B族維生素上調KDM5家族減輕PM2.5誘發孕鼠抑郁樣行為的作用及機制*

黃嘉，劉沖，佘瑛潔，劉欣琪，劉永萍，張天亮，于麗△

（1濰坊醫學院基礎醫學院，山東 濰坊 261053；2濰坊醫學院臨床醫學院，山東 濰坊 261053；3濰坊醫學院醫學研究實驗中心，山東 濰坊 261053）

大氣顆粒物（particulate matter，PM）是衡量大氣污染的重要標準，根據世界衛生組織估計，目前世界上90%以上的人口依然生活在超出標準的污染地區。PM2.5（環境中空氣動力學直徑≤2.5μm的顆粒物）因其特殊的結構和理化性質，因而其表面易攜帶大量有害元素和有毒有機物。暴露于PM2.5會引起包括氧化應激、炎癥、DNA損傷和內質網應激在內的多種機制改變，造成機體損傷［1-3］。居民生活在空氣污染較嚴重的區域出現精神疾病癥狀的風險更高，而空氣污染對孕婦的精神狀況影響尤為明顯。孕婦屬于非常脆弱的群體，整個妊娠期都處于情緒特別不穩定的狀態，是抑郁癥發生的潛在風險人群［4］。最新研究發現，PM2.5可以通過血液從肺部到達大腦，而腦內顆粒物的清除相較于機體其他器官更慢、更困難，腦內的顆粒物可以對腦組織及其周圍細胞帶來更持久的毒性作用［5］。據文獻統計，環境中PM2.5每增加10μg/m3就會增加5.1%認知功能不良的風險；PM2.5暴露量增加1μg/m3會導致認知反應時間延長2%［6-7］；妊娠期間母親PM2.5暴露量在16.4～29.3μg/m3將會增加83%的產后抑郁風險［8］。本課題組前期研究也發現，妊娠期暴露于高濃度PM2.5環境會導致孕鼠中樞性系統炎癥反應增強，B族維生素（B vitarnins，VitB）干預可以在一定程度抑制大腦皮層炎癥通路的激活［9-10］。但環境污染導致孕婦精神變化的確切機制尚不清晰。

環境損傷和遺傳因素均可導致個體的認知和情緒問題，而表觀遺傳則可能是兩者的中介［11-12］。文獻表明，組蛋白去甲基化酶KDM5家族成員在精神疾病和認知障礙中表達下降，KDM5家族調控組蛋白H3第4位賴氨酸（histone H3 lysine 4，H3K4）的去甲基化，而H3K4則與認知和精神疾病高度相關［13］。因此，我們擬進一步探究KDM5家族在B族維生素干預PM2.5致孕鼠抑郁樣行為中的表達變化，并從表觀遺傳學角度探討B族維生素改善PM2.5誘發孕鼠抑郁樣行為的作用機制。

材料和方法

1 材料

1.1 實驗動物SPF級ICR小鼠，8～9周齡，體重（28±2）g，購于山東省濟南實驗動物中心，許可證號為SCXK（魯）2019-0003。運輸至實驗環境后適應1周。飼養條件：自由飲水進食，室溫25℃左右。將雌雄小鼠按2∶1的比例合籠，次日雌鼠查出陰栓者即為妊娠第1天。

1.2 主要材料與試劑維生素B6、維生素B12和葉酸均購自Sigma；BCA蛋白濃度測定試劑盒、PCR Master Mix、蛋白預染Marker和ECL發光試劑盒均購自Thermo Scientific；Hoechst、PMSF和RIPA裂解液均購自Solarbio；Trizol購自Invitrogen；SYBR Premix Ex Taq購自TaKaRa；兔KDM5A、KDM5B、KDM5C、H3K4me3和突觸小泡蛋白（synaptophysin，SYP）單克隆抗體，兔生長相關蛋白43（growth-associated protein-43，GAP-43）多克隆抗體，鼠神經元核抗原（neuronal nuclear antigen，NeuN）和β-actin單克隆抗體均購自Abcam；兔突觸后致密蛋白95（postsynaptic density protein 95，PSD95）單克隆抗體購自Cell Signaling Technology；HRP標記的羊抗小鼠IgG和HRP標記的羊抗兔IgG均購自Proteintech；KDM5A、KDM5B、KDM5C及β-actin的引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，序列見表1。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1.Sequences of the primers for RT-qPCR

1.3 主要儀器SMARTV 3.0小動物行為學視頻采集與分析系統（Panlab）；NanoDrop 2000c核蛋白分析儀（Thermo）；基因擴增儀ProFlex PCR型（Life Technologies）；CFX96熒光定量PCR儀（Bio-Rad）；肺部液體定量霧化器（北京慧榮和科技有限公司）。

2 主要方法

2.1 PM2.5懸液的制備使用大氣顆粒物采樣器，收集2019年12月～2020年1月采暖季某地級市城區大氣PM2.5。將顆粒物過濾膜切成小塊，在低溫下用去離子水處理。超聲波振蕩4次（每次30 min）。然后收集洗脫液并在真空中冷凍干燥，將冷凍干燥的粉末保存在-20℃。以PBS為溶劑配成懸濁液，按照冬季地區PM2.5最高值1 000μg/m3，轉換為小鼠體重則為20.736μg/kg。

2.2 PM2.5暴露模型的制備與分組 查出陰栓后，將共計39只的孕鼠隨機分為對照（control）組、PM2.5組和PM2.5+VitB組，查出陰栓的當天記為E0。PM2.5暴露組：采用負壓噴霧裝置，使用氣管霧化的方式給予PM2.5暴露，每3 d一次（即E0.5、E3.5、E6.5、E9.5、E12.5和E15.5），每 次50μL PM2.5混懸液，整個孕期共6次；對照組：氣管霧化給予等量0.01 mol/L PBS；B族維生素干預組：氣管霧化給予相同劑量的PM2.5混懸液，30 min后進行B組維生素（葉酸0.6 mg·kg-1·d-1，維生素B6 11.4 mg·kg-1·d-1，維生素B12 0.2 mg·kg-1·d-1）灌胃，B族維生素混合液的制備參考文獻中的數據將人的劑量等效換算為小鼠［14］，從妊娠期第1天開始每天進行灌胃（E0.5～E17.5）。妊娠結束后的第14天，孕鼠進行行為學測試；分離其大腦皮層，分別用于分子生物學檢測、免疫熒光染色和高爾基染色，相關流程見圖1。

Figure 1.Schedule of treatment and behavioral tests in mice models.圖1 孕鼠模型建立和相關實驗時間表

2.3 曠場實驗（open-field test，OFT）孕鼠妊娠結束后的第14天進行曠場實驗，將其置于實驗箱（40 cm×40 cm×35 cm）的中心位置，然后使用Smart V3.0智能視頻跟蹤系統記錄母鼠5 min內的探索軌跡和行為學參數，包括總運動距離及在中心區域（20 cm×20 cm）的移動距離和時間。

2.4 RT-qPCR實驗大腦皮層勻漿，Trizol試劑提取總RNA并逆轉錄。使用第一鏈cDNA合成試劑盒合成cDNA。在CFX-manager 3.1系統上，使用SYBR預混料Ex TaqⅡ試劑盒進行RT-qPCR實驗。采用2-ΔΔCt法測定mRNA的變化，β-actin為內參照，KDM5A、KDM5B和KDM5C的逆轉錄和擴增反應參考之前的程序進行［15］，各引物序列詳見表1。

2.5 Western blot大腦皮層組織加入RIPA裂解液提取蛋白質，BCA試劑盒進行蛋白定量，行10%SDSPAGE。300 mA恒流轉至PVDF膜上。5%脫脂奶粉封閉2 h，Ⅰ抗孵育4℃過夜：兔源KDM5A單克隆抗體（1∶5 000），兔源KDM5B單克隆抗體（1∶1 000），兔源KDM5C單克隆抗體（1∶1 000），兔源H3K4單克隆抗體（1∶1 000），兔源SYP單克隆抗體（1∶20 000），兔源PSD95單克隆抗體（1∶1 000），兔源GAP-43多克隆抗體（1∶1 000）。TBST洗滌10 min×3次，分別加入HRP標記的羊抗兔IgG（1∶2 000），室溫孵育2 h。TBST洗滌10 min×3次。最后加入ECL發光液曝光、拍照。ImageJ凝膠分析工具定量分析條帶灰度。

2.6 免疫熒光雙標染色制備大腦皮層10μm冰凍切片，PBS洗片5 min×3次，微波抗原修復，10%羊血清37℃封閉1 h，加入Ⅰ抗4℃孵育過夜：兔源KDM5A單克隆抗體（1∶500），兔源KDM5B單克隆抗體（1∶150），兔源KDM5C單克隆抗體（1：150），鼠源NeuN單克隆抗體（1∶200）。根據Ⅰ抗種屬分別滴加Cy3標記的羊抗兔IgG（1∶200）或Alexa Fluor 488標記的羊抗鼠IgG（1∶200），37℃避光孵育1 h，Hoechst染核，37℃孵育25 min，封片觀察。

2.7高爾基染色孕鼠用5%的水合氯醛麻醉，完整剝離鼠腦，制備100μm大腦皮層冰凍切片，按照FD Rapid GolgiStain?Kit快速高爾基染色試劑盒說明書進行高爾基染色，按照說明書進行后續操作，封片。暗處晾干后觀察。

3 統計學處理

應用SPSS 25.0軟件將測出的數據進行統計學分析，實驗結果用均數±標準差（mean±SD）表示。多樣本組間均數比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 B族維生素干預可減輕PM2.5導致的孕鼠抑郁樣行為

如圖2所示，與正常對照組相比，PM2.5暴露后的孕鼠總活動距離顯著減少（P＜0.01），進入曠場中央區的時間（P＜0.05）與距離（P＜0.01）顯著減少；而與PM2.5暴露組相比，B族維生素干預組孕鼠總活動距離顯著增加（P＜0.01），在中央區活動的距離和時間亦顯著增加（P＜0.05）。由此提示，B組維生素同步干預可以明顯減輕孕期PM2.5暴露導致的孕鼠抑郁樣行為。

2 B族維生素干預可緩解PM2.5導致的孕鼠大腦皮層神經元損傷

NeuN免疫熒光染色顯示，與對照組相比，孕期暴露于PM2.5的孕鼠大腦皮層神經元的細胞核出現形狀不規則或破裂，神經元排布散亂、間隙較大，NeuN陽性細胞數量減少，染色較淺；而經過B族維生素干預后神經元細胞核形狀規則，形態有所改善，神經元排布較為整齊，NeuN陽性細胞分布和數量與對照組基本一致，提示B族維生素可以保護母體神經細胞，見圖3A。

高爾基染色結果顯示，相較于對照組，孕期暴露于PM2.5的孕鼠大腦皮層椎體神經元數量和樹突分支數量降低，神經元樹突形態的復雜性下降，且星形神經元向大腦皮層的外顆粒層分布；而經過B族維生素干預后，大腦皮層椎體神經元數量增多，樹突分支數得到一定恢復，樹突形態的復雜性也得到了一定保護，且星形神經元分布恢復正常，見圖3B。這說明孕期給予B族維生素干預可以在一定程度上保護神經元，避免PM2.5對孕鼠神經元造成的損傷。

3 B族維生素干預可減輕PM2.5暴露導致的大腦皮層突觸損傷

Western blot結果顯示，與對照組相比，孕期暴露于PM2.5的孕鼠大腦皮層軸突生長相關蛋白GAP-43蛋白表達水平下調，SYP和突觸后致密蛋白PSD95蛋白表達水平顯著下降（P＜0.05或P＜0.01）；與PM2.5暴露組相比，B族維生素干預組大腦皮層GAP-43表達水平上調，SYP和PSD95表達水平顯著上升（P＜0.05或P＜0.01），見圖4。這說明孕期給予B族維生素干預可以在一定程度上保護突觸可塑性，避免PM2.5對孕鼠的突觸可塑性造成損傷。

Figure 3.Immunofluorescent staining of NeuN（A）and Golgi staining（B）in cerebral cortex of pregnant mice in each group.The scale bar=50μm.圖3 各組孕鼠大腦皮層NeuN免疫熒光染色和高爾基染色

4 B族維生素干預可上調孕鼠大腦皮層KDM5家族的mRNA水平

RT-qPCR結果顯示，孕鼠暴露于PM2.5后，大腦皮層KDM5A、KDM5B和KDM5C的mRNA表達水平顯著低于對照組（P＜0.05或P＜0.01）；而與PM2.5暴露組相比，B族維生素干預組孕鼠大腦皮層KDM5A、KDM5B和KDM5C的mRNA表達水平也顯著上升（P＜0.05或P＜0.01），見圖5。這說明孕期給予B族維生素干預可以在mRNA水平上調KDM5家族的表達。

5 B族維生素干預可提高孕鼠大腦皮層KDM5家族蛋白水平，降低H3K4me3表達

與對照組相比，孕期暴露于PM2.5的孕鼠大腦皮層KDM5A、KDM5B和KDM5C的蛋白表達水平顯著下降（P＜0.05），H3K4me3表達水平則上升（P＜0.05），說明PM2.5可以引起孕鼠大腦皮層組蛋白甲基化水平升高；與PM2.5暴露組相比，B族維生素干預組大腦皮層KDM5A、KDM5B和KDM5C的表達水平上調（P＜0.05），而H3K4me3的蛋白表達水平降低（P＜0.05），見圖6。這說明孕期給予B族維生素可以上調KDM5家族蛋白的表達，在一定程度上減輕PM2.5導致的甲基化水平異常。

6 B族維生素干預可上調孕鼠大腦皮層神經元KDM5蛋白表達

免疫熒光雙標染色顯示，KDM5A、KDM5B和KDM5C熒光染色均主要表達在大腦皮層神經元；相較于對照組，孕期暴露于PM2.5的孕鼠大腦皮層KDM5A+/NeuN+、KDM5B+/NeuN+和KDM5C+/NeuN+雙陽性神經元數量均明顯減少；而B族維生素同步干預 后，KDM5A+/NeuN+、KDM5B+/NeuN+和KDM5C+/NeuN+雙陽性神經元數量增多，見圖7。這說明孕期B族維生素干預可通過上調神經元中KDM5蛋白的表達，緩解PM2.5暴露對神經元造成的損傷。

Figure 4.The protein expression of SYP，GAP-43 and PSD95 in cerebral cortex of pregnant mice in each group.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs PM2.5 group.圖4 各組孕鼠大腦皮層中突觸相關蛋白的表達情況

Figure 5.Relative mRNA expression of KDM5 family in cerebral cortex of pregnant mice in each group.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs PM2.5 group.圖5 各組孕鼠大腦皮層中KDM5家族的mRNA表達情況

討 論

細顆粒物是一種能對全球公共健康造成巨大危害的城市空氣污染物。越來越多的證據表明，暴露于PM2.5會損傷腦等重要器官，造成不可逆轉的嚴重損害［1-3，5］。最新研究表明，PM2.5暴露與包括抑郁癥在內的精神疾病的發生存在關聯，生活在PM2.5暴露地區會出現焦慮，甚至自殺等嚴重后果［4］。孕婦在妊娠期孕育新生命的同時也經歷著巨大的心理變化，易產生抑郁、焦慮等心理問題。對于孕期環境暴露的研究主要關注于子代的發育［12，16］，在空氣污染和妊娠的雙重壓力下觀察并探討孕婦的精神健康并尋找相應的保護治療機制迫在眉睫。組蛋白H3K4甲基化狀態作為一種與神經疾病密切相關的表觀遺傳修飾，其失衡不僅會影響機體的精神狀態，而且其去甲基化酶KDM5家族的表達也影響著機體的精神狀態［17］。KDM5家族由KDM5A、KDM5B、KDM5C和KDM5D組成，前3個成員與智力障礙、自閉癥譜系障礙和精神分裂癥等多種神經疾病密切相關［18-19］。由此我們推測，PM2.5與妊娠雙重壓力下造成的孕鼠精神狀態的改變可能與KDM5家族有關。

本課題組前期研究發現，妊娠期大氣細顆粒物暴露會導致孕鼠出現神經系統損傷［10］。有研究發現，組蛋白H3K4的甲基化修飾與神經系統損傷密切相關［17］。進一步探究顆粒物暴露致孕鼠組蛋白修飾的變化，我們檢測發現PM2.5可導致孕鼠產后大腦皮層組蛋白H3K4me3的表達水平升高，其相關的組蛋白去甲基化酶KDM5A、KDM5B和KDM5C表達均下調。說明妊娠期暴露于PM2.5會導致孕鼠組蛋白H3K4甲基化狀態增強，從而抑制基因表達。而研究發現患有神經疾病，諸如ARID、ID/ASD和MRXSCJ的個體KDM5家族的表達降低［13］，與上述結果一致。研究報道，KDM5A和KDM5C作為關鍵調控基因在ASD發病中表達水平降低［18-19］。我們之前的研究發現，孕期PM2.5會暴露會導致子代鼠出現自閉樣行為［20］。研究報道，某些表觀遺傳同樣存在跨帶遺傳現象［13］。因此，我們推測孕期暴露于PM2.5會導致孕鼠表觀遺傳發生改變，繼而通過表觀遺傳的跨代遺傳導致子鼠出現自閉癥。但這需要進一步的研究證實。

Figure 6.Relative protein epression of KDM5 family and H3K4me3 in cerebral cortex of pregnant mice in each group.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05 vs PM2.5 group.圖6 各組孕鼠大腦皮層KDM5家族及H3K4me3的蛋白表達情況

最新研究報道，機體可以通過補充維生素B來挽救因暴露于PM2.5環境而導致的DNA甲基化異常［20］，但是否可以預防PM2.5暴露所致的組蛋白甲基化異常，目前尚不明確。B族維生素具有抗炎、抗氧化的特性和免疫表觀遺傳效應［21-22］，由此我們推測B族維生素可能對空氣污染引起的疾病也有一定的保護作用。本研究建立了妊娠期B族維生素干預PM2.5損傷動物模型，發現孕鼠孕期給予一定的B族維生素干預后，大腦皮層中KDM5A、KDM5B和KDM5C的表達下降可以被挽救，H3K4的甲基化水平趨于正常。這說明B族維生素可以通過調節KDM5家族的表達一定程度上逆轉PM2.5所致的H3K4甲基化異常。近期研究表明，抑郁癥與突觸可塑性的改變關系密切［23］，我們推測PM2.5暴露調控組蛋白修飾變化導致的孕鼠抑郁樣行為可能與突觸可塑性有關，因此我們進一步研究了突觸相關蛋白的改變。突觸相關蛋白SYP是一種存在于神經末梢的突觸前囊泡蛋白，與突觸功能密切相關，是突觸前成分的標志物，與突觸可塑性關系密切；軸突膜蛋白GAP-43是一種神經特異性的蛋白質，主要參與神經細胞外生長及突觸發育形成和神經細胞再生；PSD95是突觸后密度中豐富的支架蛋白是突觸后成分的標志物，可促進突觸形成，在突觸可塑性中起重要作用［24］。在B族維生素干預后，突觸相關蛋白GAP-43、SYP和PSD95的下降可以被挽救，神經元的數量與形態也趨于正常，說明B族維生素可以在一定程度上保護母體的突觸可塑性，維持神經元正常的功能形態。

Figure 7.Immunofluorescence double staining of KDM5（red）and NeuN（green）in the cerebral cortex of pregnant mice in each group.Blue：nuclei stained by Hoechst.The scale bar=50μm.圖7 各組孕鼠大腦皮層KDM5/NeuN免疫熒光雙標染色結果

綜上所述，孕期給予B族維生素同步干預可通過上調大腦皮層KDM5的轉錄和翻譯水平，糾正組蛋白甲基化異常，減輕PM2.5造成的神經元損傷，從而緩解孕鼠抑郁樣行為。