腸道菌群對大鼠紫杉醇神經病理性疼痛模型的影響*

朱彬，鄭彩虹，邊英麟，施海濱

（1杭州市婦產科醫院，浙江 杭州 310000；2浙江大學醫學院附屬杭州市第一人民醫院，浙江 杭州 310000）

據統計，2020年全球新增腫瘤病例達1 930萬例，腫瘤死亡人數近1 000萬例［1］。紫杉醇（paclitaxel，PTX）是一種常用的抗腫瘤藥物，被廣泛用于卵巢癌、乳腺癌和前列腺癌等實體腫瘤的治療［2］。PTX是新型抗微管藥物，通過促進微管蛋白聚合抑制解聚，保持微管蛋白穩定，抑制細胞有絲分裂，從而發揮抗腫瘤作用。然而，PTX不僅僅影響腫瘤細胞，也影響中樞和外周神經系統的細胞［3］。神經毒性是PTX劑量限制性毒性的主要因素之一［4］，臨床表現為持續數月至數年的肢體麻木、疼痛以及對機械或冷刺激的超敏反應［5］，導致患者無法足量完成PTX治療。因神經毒性誘發的神經病理性疼痛的機制不明，目前尚無有效鎮痛治療方法［6］。

微生物廣泛定植于皮膚和黏膜，在胃腸道中微生物密度最大，其次是結腸部分［7］。研究顯示腸道菌群在內分泌、免疫功能以及藥物代謝、吸收方面發揮作用［8］，腸道菌群可通過“腸-軸”影響神經系統功能［9］，PTX治療可導致腸道菌群失調和腸道炎癥［10］。Shen等［11］研究顯示腸道菌群在奧沙利鉑神經病理性疼痛動物模型中發揮著關鍵作用，然而腸道菌群是否影響大鼠PTX模型的神經病理性疼痛，仍需要進一步研究。

因此，基于以上研究，本項工作擬通過構建大鼠PTX神經病理性疼痛動物模型，通過使用廣譜抗生素及糞便移植技術干預各組動物腸道菌群，觀察腸道菌群在大鼠PTX神經病理痛模型中的作用，并探討可能的分子機制。

材料和方法

1 動物

42只雄性清潔級SD大鼠，6～8周齡，200～250 g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，許可證號：SCXK（滬）2017-0005。飼養環境溫度保持在（22±1）℃，濕度保持在65%～70%，12 h明/暗光照周期，自由飲食。

2 主要試劑

PTX（HJ20171227，Italy）；組織細胞快速裂解液（RIPA）和PBS購自上海碧云天生物公司；Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）抗體（66350-1-Ig）、p38抗體（14064-1-AP）和GAPDH抗體（14064-1-AP）購自Proteintech；p-p38抗體（bs-0636R）、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）抗體（bs-10562R）和p-JNK抗體（bs-4163R）購自Bioss；細胞外信號調節激酶1/2（extracellular signal-regulated kinase 1/2，ERK1/2）抗體（Ab184699）和p-ERK1/2抗體（Ab201015）購自Abcam；BCA蛋白定量試劑盒（PICPI23223）、大鼠白細胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）ELISA檢測試劑盒（#BMS630）和大鼠腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA檢測試劑盒（#ERA56RB）均購自Thermo Scientific；Tween-20（BYL40713）購自Amresco。

3 主要方法

3.1 PTX神經病理性疼痛模型的建立及分組大鼠適應環境1周，在實驗開始前1天（D0）測大鼠的基礎痛閾值，挑選合格大鼠。使用隨機數字法將24只大鼠分為對照（control）組、PTX+生理鹽水組（PTX組）、PTX+抗生素（antibiotic，Abx）組和PTX+糞菌移植（fecal microbiota transplantation，FMT）組，每組6只。另18只大鼠隨機分為PTX+TLR4激動劑LPSPG Ultrapure組、PTX+TLR4抑 制 劑TAK242組 和PTX+p38抑制劑SB203580組，每組6只。按照文獻［12］構建PTX神經病理性疼痛模型，PTX各組在實驗開始D1、D3、D5、D7分別通過腹腔注射PTX 2 mg·kg-1·d-1（溶于2.5 mL生理鹽水），穿刺位置為下腹部，避免穿刺入膀胱及反復穿刺，以防感染和造成大鼠不適［13］。對照組于相同時點腹腔注射等體積生理鹽水。PTX+LPS-PG Ultrapure組、PTX+TAK242組和PTX+SB203580組均在造模第1天鞘內單次注射激動劑或抑制劑（參考既往研究［14］）。各組大鼠飲用水內容：PTX+Abx組飲用水中添加1.0 g/L氨芐西林鈉、1.0 g/L甲硝唑、1.0 g/L硫酸新霉素和0.5 g/L萬古霉素，與40%無菌糖漿混合，2 d更換一次，持續整個實驗；對照組、PTX組和PTX+FMT組大鼠每天飲用蒸餾水。PTX+FMT組每天固定時間給予2 mL細菌懸液灌胃，持續7 d；于同一時點，對照組、PTX組、PTX+LPS-PG Ultrapure組、PTX+TAK242和PTX+SB203580組均給予等體積蒸餾水灌胃，PTX+Abx組給予等體積的抗生素混合液灌胃。

3.2 FMT［15］收集對照組大鼠實驗前新鮮糞便顆粒，用無菌PBS（每毫升1個糞便顆粒）稀釋浸泡約15 min，搖勻后888×g、4℃離心5 min，再取懸浮液在7 104×g、4℃離心5 min后，在PBS中過濾兩次。最后的細菌懸浮液與相同體積的40%無菌糖漿混合。PTX+FMT組大鼠于造模開始，每天給予2 mL細菌懸液灌胃并持續7天。

3.3 機械縮足反射閾值（mechanical withdrawal threshold，MWT）的測定采用SLY-HFM手持式測痛儀測定。大鼠被放置于透明有機玻璃罩內，其底為細的金屬網，網格大小能夠滿足測量的需要，將大鼠放置30 min后進入安靜狀態后，用手持式測痛儀垂直由金屬網格刺入實驗動物的右側足底中部并逐漸加大刺激力度，待大鼠突然出現縮足反應時，手持式測痛儀可以自動記錄動物在縮足瞬間的機械刺激力度，儀器會自動記錄壓力讀數（單位：g），間隔5 min測1次，共連續測定5次，取平均值為此時間點大鼠的MWT，在實驗的前1天和實驗的第7、12、21天分別測定。

3.4 熱縮足潛伏期（thermal withdrawal latency，TWL）的測定采用PL-200熱刺痛儀測定。將實驗動物放在透明的有機玻璃箱中，待其自由活動逐漸處于安靜狀態時，在實驗箱底部緩慢移動熱輻射光源對于大鼠足底中部，打開熱輻射光時儀器自動記錄開始時間，光透過透明的有機玻璃板底部聚焦于大鼠足底中部皮膚，待大鼠出現抬腿回避動作時，儀器可以自動記錄時間（單位：s），即為大鼠的TWL。整個實驗過程中光照強度保持一致，為避免熱刺激時間過長造成組織損傷，光照25 s時儀器會自動切斷電源，連續測量3次，每次間隔5 min，取平均值為此時間點此只大鼠的TWL，在實驗的前1日和實驗的第7、12、21天分別測定。

3.4 Western blot在實驗結束時取結腸組織，用RIPA溶解組織，RIPA中含有0.05 mol/L Tris（pH 7.4）、0.15 mol/L氯化鈉、1%脫氧膽酸鈉、1% Triton X-100、0.1%十二烷基硫酸鈉。在4℃下溶解30 min，然后在4℃下10 656×g離心15 min，上清液保存在-80℃冰箱直至使用。采用BCA蛋白檢測試劑盒檢測上清液蛋白濃度。常規電泳分離，200 mA，90 min。用5%脫脂奶粉TBST浸泡PVDF膜室溫封閉條帶1 h，加相應Ⅰ抗（均1∶1 000稀釋），4℃孵育過夜，TBST洗脫3次，每次5 min，隨后浸泡在HRP標記的Ⅱ抗，37℃孵育1 h，用TBST洗滌3次，每次5 min。ECL發光顯色。以GAPDH作為內參照，放入成像系統（Tanon-5200）中進行掃描，使用ImageJ軟件測定蛋白印跡強度。

3.5 16S rDNA分析實驗結束收集各組大鼠糞便，利用16S rDNA進行糞便微生物分析。完成基因組DNA抽提后，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提的基因組DNA。設計合成引物進行PCR擴增，將PCR擴增產物用QuantiFluor?-ST藍色熒光定量系統（Promega）進行定量檢測。使用TruSeqTMDNA Sample Prep Kit試劑盒進行Miseq文庫構建以及測序，將MiSeq測序得到的PE reads進行樣本拆分，并進行質控、過濾、拼接。使用序列降噪方法（DADA2/Deblur等）處理優化數據，獲得ASV（Amplicon Sequence Variant）代表序列和豐度信息，進行群落組成分析以及物種差異分析。

3.6 檢測SD大鼠血清中炎癥因子的水平利用SD大鼠血漿IL-1β和TNF-αELISA檢測試劑盒檢測SD大鼠血清中炎癥因子的水平，樣品均采用復孔檢測，減少操作誤差。所有操作根據試劑盒說明書進行。

4 統計學處理

應用SPSS 25.0軟件對實驗數據進行統計分析。計量資料以均數±標準差（mean±SD）表示，計數資料以率（%）表示。多組間均數比較采用單因素方差分析，多重比較采用Bonferroni檢驗；率的比較采用卡方檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 行為學的比較

PTX造模前（D0）測各組大鼠后足MWT，結果顯示4組大鼠的MWT基礎閾值相似，差異無統計學意義（P＞0.05）。造模前測各組大鼠后足TWL，結果顯示大鼠的TWL基礎值相似，差異無統計學意義（P＞0.05）。對照組比較，PTX組大鼠在造模后第7、12、21天后足MWT和TWL均顯著降低（P＜0.01），隨著造模時間的延長，PTX組MWT和TWL均呈下降趨勢，在造模第21天，達到最低點。PTX+FMT組較正常對照組大鼠MWT和TWL下降趨勢，在造模第12、21天，PTX+FMT組MWT和TWL均較PTX組高（P＜0.05）。PTX+Abx組大鼠飲用廣譜抗生素后，MWT和TWL在第7、12、21天均呈現下降趨勢，但與PTX組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1、2。

表1 紫杉醇處理后大鼠機械痛反射閾值比較Table 1.Comparision of mechanical withdrawal threshold in rats after paclitaxel（PTX）treatment（g.Mean±SD.n=6）

表2 紫杉醇處理后大鼠熱縮足潛伏期比較Table 2.Comparision of thermal withdrawal latency in rats after paclitaxel（PTX）treatment（s.Mean±SD.n=6）

2 腸道菌群差異的比較

使用16S rDNA基因測序技術測定各組大鼠腸道菌群的組成及豐度。PTX組、PTX+FMT組和PTX+Abx組的腸道菌群較對照組均發生改變。根據樣本間群落豐度的相似性進行聚類，將結果呈現在以顏色梯度來表示群落物種組成的群落Heatmap圖上。使高豐度和低豐度的物種分塊聚集，通過顏色變化與相似程度來反映不同分組在各分類水平上群落組成的相似性和差異性，并根據得到的群落豐度數據，評估各組間物種豐度差異的顯著性水平，結果顯示各 組 間Muribaculaceae（P=0.001）、Romboutsia（P=0.003）、Turicibacter（P＜0.001）、Corynebacterium（P＜0.001）、Oscillospiraceae（P＜0.001）、UCG-005（P=0.04）、UCG-014（P=0.04）等菌屬均有顯著差異，見圖1。

3 大鼠TLR4和MAPKs家族蛋白的表達

Western blot顯示，與對照組比較，PTX組大鼠TLR4、p-p38、p-JNK及p-ERK1/2蛋白水平均顯著上調（P＜0.05）；與對照組比較，PTX+Abx組TLR4、pp38、p-JNK和p-ERK1/2蛋白水平均顯著上調（P＜0.01）；PTX+FMT組TLR4、p-p38、p-JNK和p-ERK1/2蛋白水平與對照組比較無顯著差異（P＞0.05），見圖2。

4 PTX模型大鼠鞘內注射TLR4激動劑LPS-PG Ultrapure、TLR4抑 制 劑TAK242或p38抑 制 劑SB203580對大鼠行為學及炎癥因子表達的影響

PTX模型大鼠造模第1天（D1）鞘內單次注射LPS-PG Ultrapure，D7時大鼠MWT和TWL較對照組均顯著下降（P＜0.01）；PTX模型大鼠D1鞘內單次注射TAK242或SB203580，均可逆轉PTX大鼠MWT及TWL下降趨勢，兩組MWT和TWL均較PTX組顯著升高（P＜0.01），見表3，4。

表3 LPS-PG Ultrapure、TAK242或SB203580鞘內注射后大鼠機械痛反射閾值比較Table 3.Mechanical withdrawal threshold in rats after intrathecal injection of LPS-PG Ultrapure，TAK242 or SB203580（g.Mean±SD.n=6）

SD大鼠血清ELISA結果顯示，PTX誘導的神經病理性疼痛大鼠模型中血清炎癥因子TNF-α和IL-1β水平均高于對照組（P＜0.01）；PTX組大鼠D1鞘內注射LPS-PG Ultrapure后，大鼠血清中炎癥因子IL-1β和TNF-α水平均顯著高于對照組和PTX組（P＜0.01）；PTX模 型 大 鼠 鞘 內 給 予TAK242或SB203580，大鼠血清中炎癥因子IL-1β和TNF-α水平較PTX組顯著下降（P＜0.01），但仍較對照組高（P＜0.01），見表5。

表5 紫杉醇大鼠模型鞘內注射LPS-PG Ultrapure、TAK242、SB203580后大鼠血清ELISA指標檢測結果Table 5.The ELISA results of serum inflammatory factors after intrathecal injection of LPS-PG Ultrapure，TAK242 and SB203580 in paclitaxel（PTX）model rats（ng/L.Mean±SD.n=6）

討 論

Figure 1.Differential profiles of gut microbiota among control，PTX group，PTX+Abx group and PTX+FMT group（n=6）.A：heatmap of different levels among the groups；B：species difference analysis among groups.圖1 各組腸道菌群群落組成差異圖

PTX是一線的抗腫瘤藥物，主要副作用是劑量依賴性的神經病理性疼痛［16］。高劑量PTX可引起軸突退行性改變，低劑量可觸發過敏性疼痛，包括異位性疼痛和痛覺過敏［17］。腸道菌群與神經系統疾病（包括慢性疼痛）之間的關系越來越受到關注。腸道菌群是內臟疼痛的關鍵調節因子，而最近的證據表明，腸道菌群在許多其他類型的慢性疼痛中也可能發揮關鍵作用，包括炎癥性疼痛、頭痛和神經病理性疼痛等［18-19］。

Figure 2.The protein levels of TLR4，p-p38，p-JNK and p-ERK1/2 detected by Western blot.Mean±SD.n=6.*P＜0.05，**P＜0.001 vs control group；#P＜0.05 vs PTX group.圖2 TLR4和MAPKs家族蛋白的表達

在本研究中，我們以腸道菌群為切入點，通過干擾PTX模型大鼠的腸道菌群，探討腸道微生物在PTX誘導的神經性疼痛模型中的作用，驗證通過改變腸道菌群是否可以減輕PTX引起的神經病理性疼痛，并尋找可能的相關分子機制。實驗通過建立PTX大鼠模型，分組給予廣譜抗生素或移植正常大鼠糞便菌群，改變大鼠的腸道菌群的相對豐度。本實驗通過喂飼PTX模型大鼠廣譜抗生素，有效減少大鼠腸道內菌群，可降低大鼠的機械痛閾值和熱縮足反射閾值，導致大鼠機械痛、熱痛痛覺過敏，促進大鼠TLR4、p-p38、p-JNK及p-ERK1/2等信號蛋白的表達；而移植正常對照組大鼠糞便菌群的PTX模型大鼠，可減輕機械痛閾值和熱縮足反射閾值下降趨勢，緩解大鼠機械痛、熱痛痛覺過敏，并抑制大鼠TLR4、p-p38、p-JNK及p-ERK1/2等信號蛋白的表達。16S rDNA分析各組大鼠腸道菌群，實驗結果顯示PTX治療可引起腸道菌群失調，與既往的研究結果一致［20］，各組大鼠腸道菌屬豐度存在顯著差異，其中Muribaculaceae［21］、Romboutsia［22］、Turicibacter［23］、瘤胃球菌UCG-005及UCG-014［24］與維持腸道上皮細胞功能的穩定、抑制炎癥和減少上皮細胞的凋亡有關。以上實驗結果顯示，腸道菌群在PTX誘導的神經病理性疼痛中的重要作用，通過調整腸道菌群可改善PTX模型大鼠的神經病理性疼痛。我們的研究為預防PTX化療引起的神經病理性疼痛提供了參考資料。

表4 LPS-PG Ultrapure、TAK242或SB203580鞘內注射后大鼠熱縮足潛伏期比較Table 4.Comparision of thermal withdrawal latency in rats after intrathecal injection of LPS-PG Ultrapure，TAK242 or SB203580（s.Mean±SD.n=6）

既往研究顯示，中樞神經系統中的TLR4在嚙齒類動物神經性疼痛模型的行為超敏反應中發揮作用［14，25］。結合本實驗結果顯示，PTX造模后可促進結腸組織TLR4的激活和MAPKs家族相關蛋白的磷酸化，但移植對照組正常腸道糞便菌群后，可明顯抑制TLR4及MAPKs家族相關蛋白的磷酸化表達。結合既往研究［14］，本實驗選擇給予PTX模型大鼠鞘內注射TLR4抑制劑TAK242或p38抑制劑SB203580，結果顯示均可抑制TLR4和p-p38蛋白的表達，說明TLR4與p38可能存在信號表達的上下游關系。PTX模型大鼠鞘內注射抑制劑還可減少炎癥因子IL-1β和TNF-α的表達水平，并緩解大鼠的機械痛和熱痛覺過敏，阻止PTX誘導的神經病理性疼痛的發展，但不能逆轉大鼠行為學的改變。本實驗結果提示TLR4-MAPKs信號通路可能參與PTX誘導的神經病理性疼痛的發生發展，是否還有其他信號通路參與神經病理性疼痛的發展還需要進一步研究。

綜上所述，PTX治療可改變大鼠腸道菌群種屬及豐度，促進炎癥因子的釋放，激活TLR4和MAPKs，促進大鼠的機械痛和熱痛痛覺過敏。我們的研究結果表明腸道菌群參與PTX誘導的大鼠神經病理性疼痛的發生與發展，可能通過激活TLR4-MAPKs信號通路，但仍需要進一步研究。