膜聯蛋白A1的N末端肽Ac2-26對高糖刺激的小鼠巨噬細胞極化的影響*

夏崇建，黃俊杰，張煜，卓嘉英，吳娟娟，陳剛，范琰琰

（溫州醫科大學基礎醫學院，浙江 溫州 325035）

糖尿病是以高血糖為特征的代謝性疾病，在中國成人中發病率高，可引起多種并發癥［1-3］。其中，糖尿病患者的傷口難以愈合已成為醫學界研究的重點問題之一［3］。傷口內浸潤的巨噬細胞是介導傷口炎癥期向增殖期過渡的關鍵細胞，在炎癥期它們極化為M1表型介導炎癥反應，在增殖期它們極化為M2表型促進傷口修復［4］。在糖尿病傷口愈合期間，巨噬細胞呈現從M1型向M2型的轉換障礙，繼而引起傷口內持續的炎癥反應及修復遲滯［3-4］。

膜聯蛋白超家族在結構上均具有保守的中心結構域和承擔獨特功能的N端結構域，膜聯蛋白A1（annexin A1，ANXA1）屬于該家族的一員，被體內多種細胞表達，其與甲酰肽受體2（formyl peptide receptor 2，FPR2）結合可發揮抗炎、保護神經元和促進腸黏膜修復等作用［5-8］。ANXA1裂解后可產生N末端肽Ac2-26，Ac2-26具有ANXA1的類似功能［5-6］。我們的前期研究提示，對糖尿病小鼠傷口應用Ac2-26可抑制傷口內的炎癥反應，并上調M2型巨噬細胞數量，但其作用機制尚不清楚［9］。在本研究中，我們擬體外培養小鼠骨髓來源的巨噬細胞（bone marrow-derived macrophage，BMDM）并予以高糖刺激，在此基礎上探討Ac2-26對高糖刺激的小鼠巨噬細胞極化的影響及其機制。

材料和方法

1 實驗材料

清潔級C57BL/6雄性小鼠36只，6～8周齡，20～25 g，購自南京大學生物醫藥研究院，許可證號為SCXK（蘇）2018-0008。DMEM培養液、D-葡萄糖和胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）購自Thermo Fisher；巨噬細胞集落刺激因子（macrophage colony-stimulating factor，M-CSF）購自Merck；Ac2-26和FPR2拮抗劑WRW4購自Tocris Bioscience；磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）抑制劑wortmannin購自碧云天生物技術有限公司；腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）、IL-10和 轉化 生 長 因 子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）ELISA試劑盒購自R&D；抗F4/80抗體、抗ANXA1抗體、抗誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）抗 體 及 抗 甘 露 糖 受 體（mannose receptor）/CD206抗體購自Abcam；抗PI3K及磷酸化PI3K（p-PI3K）抗體、抗蛋白激酶B（protein kinase B，PKB/AKT）及磷酸化AKT（p-AKT）抗體和β-actin抗體購自Cell Signaling Technology；辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的Ⅱ抗購自Biorbyt。

2 主要方法

2.1 小鼠BMDM的提取與培養處死小鼠后，將其放置在75%的乙醇中消毒3 min。然后分離出小鼠的股骨和脛骨，置入含75%乙醇的培養皿中，轉移至超凈工作臺。在無菌環境下，使用預冷的PBS洗去骨表面的乙醇，并剔除骨周圍的軟組織，將股骨和脛骨分開，再將骨置入PBS中清洗3次。然后剪掉骨的兩端，用含2% FBS的PBS將骨髓沖出，離心、棄上清，用含M-CSF（10μg/L）、D-葡萄糖（5.5 mmol/L）、10% FBS及1%青鏈霉素的DMEM培養液重懸骨髓細胞，放入37℃、5% CO2環境的孵箱中培養，第3天和第5天更換新鮮的培養液，第7天收集貼壁的細胞。使用F4/80抗體檢測巨噬細胞純度，每次獲得的巨噬細胞純度均在90%以上［10-11］。

2.2 高糖刺激將BMDM接種，培養過夜讓其貼壁后換液，加入含30 mmol/L葡萄糖的DMEM培養液［12］，分別在高糖刺激后的6、12和24 h收集細胞。另外，直接收集培養過夜的貼壁細胞作為高糖刺激0 h的細胞。

2.3 干預實驗將BMDM接種、培養過夜讓其貼壁，然后對細胞進行分組處理：（1）對照（control）組：用含5.5 mmol/L葡萄糖的DMEM培養液進行培養；（2）高糖（high glucose，HG）組：用含30 mmol/L葡萄糖的DMEM培養液進行培養；（3）高糖+Ac2-26（HG+Ac2-26）組：在含30 mmol/L葡萄糖的DMEM培養液中加入Ac2-26（1μmol/L或5μmol/L）［13］；（4）高糖+Ac2-26+FPR2拮抗劑（WRW4）組：在含30 mmol/L葡萄糖的DMEM培養液中加入WRW4（10μmol/L）［13］，孵育30 min后再加入Ac2-26（5μmol/L）；（5）高糖+Ac2-26+PI3K抑制劑（wortmannin）組：在含30 mmol/L葡萄糖的DMEM培養液中加入Ac2-26（5μmol/L）和wortmannin（1μmol/L）［14-15］。各組在干預24 h后收集細胞及其培養液，進行后續檢測。

2.4 ELISA檢測將細胞培養液離心、取上清，使用ELISA試劑盒檢測上清液中TNF-α、IL-6、IL-10和TGF-β1的含量。檢測步驟按照試劑盒制造商的說明書進行。

2.5 Western blot檢測用含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液提取細胞總蛋白，測定蛋白濃度、配平。在每個蛋白樣品中加入上樣緩沖液，金屬浴加熱5 min，使蛋白充分變性。將蛋白樣品上樣、電泳、轉至PVDF膜上，然后將膜轉移至5%脫脂牛奶中封閉2 h，再使用相應的Ⅰ抗孵育過夜。TBST洗膜3次，HRP標記的Ⅱ抗室溫孵育2 h。洗膜3次后，使用ECL試劑盒發光顯影。曝光成像后，用ImageJ軟件分析各顯影條帶。

3 統計學處理

用SPSS 26.0統計軟件分析數據。數據采用均數±標準誤（mean±SEM）表示，多組間比較采用單因素方差分析，事后比較采用LSD法。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 不同時間的高糖刺激對小鼠BMDM的iNOS、CD206及ANXA1表達的影響

實驗結果表明，與高糖刺激0 h相比，iNOS（M1型極化標志物）的表達在高糖刺激12 h后開始顯著升高（P＜0.05），于刺激24 h后進一步升高（P＜0.01）；高糖刺激24 h后也顯著下調了CD206（M2型極化標志物）的表達（P＜0.05）；高糖刺激6、12和24 h沒有顯著影響小鼠BMDM的ANXA1表達，見圖1。后續的干預實驗選取24 h為干預時點。

Figure 1.The time-dependent effects of high glucose（30 mmol/L）on the expression of iNOS，CD206，and ANXA1 in BMDM.A and D：the protein expression of iNOS，CD206，and ANXA1 in BMDM was detected by Western blot；B，C and E：the protein levels of iNOS，CD206，and ANXA1 were evaluated by normalizing againstβ-actin.Mean±SEM.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs 0 h group.圖1 不同時間的高糖刺激對iNOS，CD206及ANXA1表達的影響

2 Ac2-26對高糖環境下小鼠BMDM極化的干預效應及WRW4對Ac2-26作用的影響

Western blot檢測結果顯示，與正常糖濃度的對照組相比，高糖組的iNOS表達顯著增加（P＜0.01），CD206的表達顯著減少（P＜0.05）；與高糖組相比，Ac2-26（1μmol/L或5μmol/L）能夠顯著抑制iNOS的表 達（P＜0.05，P＜0.01），促 進CD206的表 達（P＜0.01）；與高糖+Ac2-26（5μmol/L）組相比，WRW4（10μmol/L）抑制了Ac2-26（5μmol/L）的干預效應，顯著上調了iNOS的表達（P＜0.05），下調了CD206的表達（P＜0.01），見圖2。

ELISA檢測結果顯示，與對照組相比，高糖組BMDM產生的TNF-α和IL-6顯著增多（P＜0.01），而IL-10的分泌顯著減少（P＜0.01）；與高糖組相比，Ac2-26（1μmol/L或5μmol/L）可以顯著下調TNF-α和IL-6的產生（P＜0.05，P＜0.01），Ac2-26（5μmol/L）可以顯著上調IL-10的產生（P＜0.01）；與高糖+Ac2-26（5μmol/L）組相比，WRW4（10μmol/L）顯著抑制了Ac2-26（5μmol/L）對TNF-α、IL-6和IL-10分泌的調節作用（P＜0.05，P＜0.01）；見圖3A～3C。TGF-β1的分泌在各干預組之間無顯著差異，見圖3D。

Figure 2.The effects of high glucose，Ac2-26，and WRW4 on the expression of iNOS and CD206 in BMDM.A：the protein expression of iNOS and CD206 in BMDM was detected by Western blot；B and C：the protein levels of iNOS and CD206 were evaluated by normalizing againstβ-actin.Mean±SEM.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs HG group；△P＜0.05，△△P＜0.01 vs HG+Ac2-26 group.圖2 高糖、Ac2-26及WRW4對iNOS和CD206表達的影響

Figure 3.The effects of high glucose，Ac2-26，and WRW4 on the secretion of cytokines in BMDM.A to D：the concentrations of TNF-α，IL-6，IL-10，and TGF-β1 in the culture supernatants of BMDM were measured by ELISA，respectively.Mean±SEM.n=3.**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs HG group；△P＜0.05，△△P＜0.01 vs HG+Ac2-26 group.圖3 高糖、Ac2-26及WRW4對BMDM細胞因子分泌的影響

3 高糖、Ac2-26及WRW4對細胞內PI3K/AKT信號通路的影響

為了探討高糖和Ac2-26影響巨噬細胞極化的機制，我們檢測了PI3K/AKT信號通路在小鼠BMDM中的激活情況。檢測結果顯示，與對照組相比，高糖組PI3K和AKT的磷酸化相對水平顯著降低（P＜0.05）；與高糖組相比，Ac2-26（1μmol/L或5μmol/L）可以顯著 上 調PI3K和AKT的 磷 酸 化 水 平（P＜0.05，P＜0.01），促進PI3K/AKT的激活；與高糖+Ac2-26（5μmol/L）組相比，WRW4（10μmol/L）抑制了Ac2-26（5μmol/L）的干預效應，顯著下調了PI3K和AKT的磷酸化水平（P＜0.05或P＜0.01），見圖4。

Figure 4.The effects of high glucose，Ac2-26，and WRW4 on PI3K/AKT signaling pathway in BMDM.A：Western blot analysis of PI3K，p-PI3K，AKT，and p-AKT in BMDM；B：relative level of p-PI3K/PI3K；C：relative level of p-Akt/Akt.Mean±SEM.n=3.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs HG group；△P＜0.05，△△P＜0.01 vs HG+Ac2-26 group.圖4 高糖、Ac2-26及WRW4對細胞內PI3K/AKT信號通路的影響

4 PI3K抑制劑對高糖環境下Ac2-26調節小鼠BMDM極化的影響

為了進一步探討Ac2-26是否通過PI3K/Akt信號通路調節高糖刺激的小鼠巨噬細胞極化，高糖刺激的小鼠BMDM被予以Ac2-26干預或Ac2-26+PI3K抑制劑（wortmannin）的干預，然后檢測巨噬細胞極化標志物的表達情況。檢測結果顯示，與高糖+Ac2-26組相比，應用PI3K抑制劑（wortmannin）顯著抑制了Ac2-26對BMDM極化標志物表達的影響，上調了iNOS的 表達（P＜0.05），下 調了CD206的 表 達（P＜0.01），見圖5。

Figure 5.PI3K inhibitor（wortmannin）inhibited the effects of Ac2-26 on BMDM polarization in high glucose environment.A：the protein expression of iNOS and CD206 in BMDM was detected by Western blot；B and C：the protein levels of iNOS and CD206 were evaluated by normalizing againstβ-actin.Mean±SEM.n=5.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs HG group；△P＜0.05，△△P＜0.01 vs HG+Ac2-26 group.圖5 PI3K抑制劑對高糖環境下Ac2-26調節小鼠BMDM極化的影響

討 論

巨噬細胞是機體內重要的免疫細胞，具有吞噬、殺菌、呈遞抗原、促炎、抗炎及促修復等多種功能。巨噬細胞的功能多樣性可能與其表型的可塑性有關，在不同微環境的刺激下，巨噬細胞可以向M1或M2表型極化［16-17］。M1型巨噬細胞高表達iNOS和促炎因子，參與促炎反應及病菌清除；而M2型巨噬細胞高表達CD206及精氨酸酶1（arginase-1，Arg-1）等，可以分泌抗炎因子或生長因子，抑制炎性反應，促進損傷修復［3-4，16-17］。

糖尿病伴有免疫反應異常，可引起持續的炎癥損害，繼而促進糖尿病及其并發癥的發展［18-22］。高血糖誘導單核巨噬細胞向促炎的M1表型極化，可能與上述的病理生理進程有關［21-23］。我們的前期研究提示，應用Ac2-26可以抑制小鼠糖尿病傷口的炎癥反應，并上調傷口內M2型巨噬細胞的數量，促進傷口愈合［9］。Ac2-26是分子量較小的多肽，合成的成本較低，明確其作用機制，再轉化于臨床治療，將有較好的開發利用前景。

本研究顯示，高糖刺激可以上調小鼠BMDM的iNOS表達及促炎因子（TNF-α和IL-6）產生，下調CD206表達和抗炎因子（IL-10）產生。使用Ac2-26對高糖刺激的小鼠BMDM進行干預，可抑制高糖的促炎作用和iNOS表達，并上調BMDM的CD206表達和IL-10產生。本研究結果提示，高糖刺激可以誘導小鼠BMDM向促炎的M1型極化，而Ac2-26可以抑制高糖的刺激作用，促進BMDM向抗炎的M2型極化。

TGF-β是一種促進纖維性修復的生長因子，在傷口愈合期間主要由巨噬細胞分泌，繼而介導成纖維細胞增殖和肌成纖維細胞分化［4］。我們的前期研究顯示，應用Ac2-26可以上調小鼠糖尿病傷口內TGF-β的蛋白水平［9］。而本研究表明，高糖刺激和Ac2-26干預均未顯著影響小鼠BMDM分泌TGF-β1，提示Ac2-26不能直接調節TGF-β的產生。據文獻報道，Ac2-26可以促進巨噬細胞吞噬凋亡的中性粒細胞，此吞噬過程伴隨著TGF-β的釋放［24］。在小鼠糖尿病傷口愈合期間，Ac2-26是否可增強巨噬細胞對凋亡細胞的吞噬作用，繼而促進TGF-β的分泌，仍需進一步研究證實。

PI3K/AKT是經典的細胞內信號轉導通路，它的激活可抑制炎癥反應、促進巨噬細胞向M2型極化，而抑制PI3K/AKT信號通路可以促進M1型極化［25-27］。本研究顯示，高糖刺激可減少PI3K/AKT在小鼠BMDM中的磷酸化水平，抑制PI3K/AKT的激活，而應用Ac2-26可以促進PI3K/AKT的激活。而且，PI3K/AKT信號通路抑制劑（wortmannin）抑制了Ac2-26對BMDM極化標志物表達的影響。研究結果提示，Ac2-26可能通過PI3K/AKT信號通路調節小鼠BMDM的極化。

FPR2是介導ANXA1抗炎作用的受體，屬于G蛋白偶聯受體家族，被激活后可啟動細胞內的信號轉導［5-6，28］。而且，Ac2-26可通過激活FPR2調節小膠質細胞的極化［13］。本研究顯示，使用FPR2拮抗劑（WRW4）抑制了Ac2-26的干預效應，提示FPR2可能介導了Ac2-26對小鼠BMDM極化的調控。但是，小鼠BMDM本身也表達ANXA1，WRW4也有可能阻斷內源性ANXA1和FPR2的結合。鑒于ANXA1和Ac2-26在功能上的相似性，WRW4的干預效果也可能部分來自于其對內源性ANXA1作用的阻斷。此外，本研究顯示高糖刺激24 h未顯著影響小鼠BMDM的ANXA1蛋白表達。據文獻報道，高糖刺激48 h可上調大鼠心肌細胞內ANXA1 mRNA的表達［29］，刺激72 h可下調人類成纖維細胞的ANXA1蛋白表達［30］。由此可見，不同類型的細胞受到不同時間的高糖刺激，可以對ANXA1的表達產生不同的影響。至于長期高糖刺激對巨噬細胞ANXA1表達的影響、高糖環境下內源性ANXA1在巨噬細胞極化中的作用，尚需研究闡明。

綜上所述，本研究提示Ac2-26可以抑制高糖誘導的M1型巨噬細胞極化，并促進小鼠BMDM向抗炎的M2型極化，FPR2/PI3K/AKT信號通路的激活可能介導了Ac2-26對小鼠BMDM極化的調控。