KIM-1對AGEs誘導的腎小管上皮細胞EMT和凋亡的影響及其機制*

張霄，張睿，吳妍，李寧，曹雷，張長庚△

（1衡水市人民醫院檢驗科，河北 衡水 053000；2河北醫科大學第一醫院中心實驗室，河北 石家莊 050031；3衡水市人民醫院腎內科，河北 衡水 053000）

糖尿病腎病（diabetic kidney disease，DKD）是糖尿病人常見并發癥之一，以進行性腎間質纖維化（renal interstitial fibrosis，RIF）形成為特征，可引起終末期腎病，已成為糖尿病患者死亡的重要病因［1］。然而，DKD的發病機制仍不明確，既往的研究大多集中在腎小球病變，而缺乏對腎小管間質病變的研究。目前大量研究發現，與腎小球硬化相比，腎小管間質纖維化更能反應腎臟的損傷程度［2-4］。腎小管與尿液直接接觸，而尿液中的葡萄糖、晚期糖基化終產物（advanced glycation end products，AGEs）和蛋白等有毒、有害物質可激活多種信號通路，引起腎小管上皮細胞的損傷［4］。研究發現，高糖可誘導腎小管上皮細胞的凋亡，并激活自噬，導致小管萎縮和功能障礙，是小管間質纖維化的關鍵過程［4］。AGEs作為DKD重要的致病因素之一，可通過調節JMJD1A/NR4A1信號通路等多種途徑影響上皮-間充質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）［5］。腎損傷分子1（kidney injury molecule-1，KIM-1）是由受損的近端腎小管上皮細胞特異性表達的一種跨膜糖蛋白，可參與腎小管上皮細胞的自噬、凋亡、氧化應激、信號轉導、炎癥反應和免疫反應等多種生物過程，在腎損傷中具有重要意義［6-7］。已有研究報道高糖可刺激腎小管上皮細胞中KIM-1高表達［4］。然而，KIM-1在AGEs誘導的人近端腎小管上皮HK-2細胞中的表達及其對EMT和凋亡的影響及機制尚不清楚。本研究從細胞實驗入手，觀察KIM-1在AGEs狀態下HK-2細胞中的表達，并通過轉染的方法敲減細胞中KIM-1的水平，探討KIM-1在AGEs誘導的HK-2細胞EMT和凋亡中的作用及可能的機制，為DKD的防治提供實驗依據。

材料和方法

1 細胞和主要試劑

HK-2細胞購自中國科學院上海細胞庫。AGEs購于Abcam；DMEM/F12培養液和無支原體胎牛血清均購于Gibco；LipofectamineTM3000轉染試劑和TRIzol均購于Invitrogen；KIM-1小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）和陰性對照（negative control，NC）siRNA均購于Santa Cruz；反轉錄試劑盒和realtime PCR定量檢測試劑盒均購于天根生化科技（北京）有限公司；MTS購于Promega；KIM-1抗體購于Novus；E-cadherin抗體購于Invitrogen；α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）抗體、β-actin抗體和FITC標記的山羊抗兔熒光Ⅱ抗購于萬類生物科技有限公司；Bcl-2相關X蛋白（Bcl-2-associated X protein，Bax）抗體購于Abcam；Bcl-2和caspase-3抗體購于Proteintech；細胞外信號調節激酶1/2（extracellular signal-regulated kinase 1/2，ERK1/2）和磷酸化ERK1/2（phosphorylated ERK1/2，p-ERK1/2）抗體購于Cell Signaling Technology；DyLight 680標記的驢抗兔熒光Ⅱ抗和DyLight 800標記的驢抗小鼠熒光Ⅱ抗購于Abbkine；TUNEL BrightRed凋亡檢測試劑盒購于Vazyme；活性氧（reactive oxygen species，ROS）檢測試劑盒、annexin V-FITC/碘化丙啶（propidium iodide，PI）凋亡檢測試劑盒和4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（4′，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）購于Solarbio。

2 主要方法

2.1 細胞培養及分組HK-2細胞加入含10%胎牛血清和0.5%青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM/F12細胞培養液中，在37℃、5% CO2培養箱中孵育。細胞長至70%～80%時進行傳代，取對數生長期的細胞進行實驗。首先使用100 mg/L的AGEs分別處理HK-2細胞0、12、24和48 h，以確定最佳的作用時間。隨后將HK-2細胞分為4組：對照組（正常DMEM/F12培養液培養）、AGEs組（使用含100 mg/L AGEs的DMEM/F12培養液培養48 h）、AGEs+NC siRNA組（80 nmol/L NC siRNA轉 染6 h后，使 用 含100 mg/L AGEs的DMEM/F12培養液培養48 h）和AGEs+KIM-1siRNA組（80 nmol/LKIM-1siRNA轉染6 h后，使用含100 mg/L AGEs的DMEM/F12培養液培養48 h）。

2.2 HK-2細胞轉染siRNA嚴格按照LipofectamineTM3000轉染試劑盒說明書的步驟。轉染前一天，將處于對數生長期的HK-2細胞按1×105個/孔均勻接種到6孔板中，待細胞達到70%～90%匯合度時轉染。使用無血清無抗生素的培養液將LipofectamineTM3000轉染試劑和siRNA稀釋并混合（2∶1），室溫下靜置20 min后加入到6孔板中繼續培養，6 h后更換新鮮培養液進行常規培養。

2.3 免疫熒光檢測HK-2細胞中KIM-1蛋白表達向6孔板中加入1×PBS洗滌細胞2次，接著加入1 mL 4%多聚甲醛，固定5 min。1×PBS洗3次后，5%BSA封閉1 h。KIM-1抗體（1∶200）孵育，并放入4℃冰箱內過夜。1×PBS沖洗3次后，加入1 mL FITC標記的山羊抗兔熒光Ⅱ抗（1∶500），室溫孵育45 min。1×PBS沖洗3次后，用DAPI對細胞核進行復染。1×PBS沖洗3次后，用倒置熒光顯微鏡觀察并拍照。

2.4 Western blot檢測HK-2細胞中KIM-1、α-SMA、E-cadherin、Bcl-2、Bax、caspase-3、ERK1/2和p-ERK1/2蛋白水平將各組HK-2細胞進行充分裂解，獲得總蛋白，使用BCA法對總蛋白進行定量檢測。取等量蛋白進行SDS-PAGE，待蛋白分離后，將分離的蛋白轉移到硝酸纖維素膜上。使用7%的BSA室溫封閉1 h。加入Ⅰ抗（KIM-1、α-SMA、E-cadherin、Bcl-2、Bax、caspase-3和ERK1/2抗體，1∶2 000；p-ERK1/2抗體，1∶500；β-actin抗體，1∶5 000），于4℃冰箱中孵育過夜。24 h后加入Ⅱ抗，室溫避光孵育45 min。使用Odyssey掃描儀掃描目的條帶，Image-Pro Plus軟件計算條帶灰度值。以目的蛋白條帶灰度值與β-actin條帶灰度值的比值代表目的蛋白的相對表達量。

2.5 RT-qPCR檢測HK-2細 胞中KIM-1的mRNA表達向各組HK-2細胞中加入TRIzol進行裂解，提取總RNA，并逆轉錄為cDNA，最后進行RT-qPCR檢測。由上海生工生物有限公司合成所需引物，序列見表1。以β-actin作為內參照，采用2-ΔΔCt法計算各組HK-2細胞中KIM-1 mRNA的相對表達量。

表1 引物序列Table 1.The sequences of the primers

2.6 MTS檢測HK-2細胞活力向含有HK-2細胞的96孔板中加入10μL MTS溶液，繼續孵育3 h。選擇490 nm波長，在酶標儀上讀取吸光度（A）。計算各組細胞相對活力，實驗重復3次，取平均值。細胞相對活力（%）=實驗組A值/對照組A值×100%。

2.7 流式細胞術檢測HK-2細胞凋亡嚴格按照annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒說明書操作。向處理好的各組HK-2細胞中加入100μL 1×Binding Buffer重懸細胞。再加入5μL annexin V-FITC和5μL PI Staining Solution，充分混勻。避光、室溫孵育10 min后加入400μL 1×Binding Buffer。使用Cytomics FC 500流式細胞儀進行檢測。流式圖的右下象限（早期凋亡細胞）和右上象限（晚期凋亡細胞）記為凋亡細胞。

2.8 TUNEL法檢測HK-2細胞凋亡 處理好的HK-2細胞去除培養液后加入適量4%多聚甲醛固定20 min。PBS清洗兩次后加入20 mg/L的Proteinase K溶液500μL，并孵育5 min。加入500μL 1×Equilibration Buffer覆蓋樣本，室溫平衡30 min。再加入TdT孵育緩沖液，37℃孵育60 min。DAPI復染，使用熒光顯微鏡在620 nm熒光下觀察BrightRed紅色熒光，在460 nm熒光下觀察DAPI藍色熒光。

2.9 流式細胞術檢測HK-2細胞ROS嚴格按照ROS檢測試劑盒說明書操作，用無血清培養液按1∶1 000稀釋DCFH-DA至終濃度為10μmol/L，4℃、避光孵育20 min。用無血清的細胞培養液洗滌3次，以充分去除未進入細胞內的DCFH-DA。使用Cytomics FC 500流式細胞儀進行檢測。

3 統計學處理

使用SPSS 17.0軟件進行統計學分析，GraphPad Prism 5.0軟件進行作圖。所得計量資料以均數±標準差（mean±SD）來表示。兩組間均數比較采用t檢驗；多組間均數比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 AGEs對HK-2細胞中KIM-1表達的影響

免疫熒光結果顯示，HK-2細胞中KIM-1蛋白低表達，而經AGEs處理后，KIM-1蛋白表達顯著升高，見圖1A。Western blot和RT-qPCR結果顯示，AGEs處理后，HK-2細胞中KIM-1的蛋白和mRNA表達呈時間依賴性升高（P＜0.05或P＜0.01），見圖1B、C。以上實驗結果表明，AGEs處理可誘導HK-2細胞中KIM-1的表達。

Figure 1.Effect of AGEs on KIM-1 expression in HK-2 cells.A：representative photomicrographs showing immunofluorescence of KIM-1 in different groups；B：Western blot was used to detect the protein level of KIM-1 in HK-2 cells after AGEs treatment；C RT-qPCR was used to detect the mRNA level of KIM-1 in HK-2 cells after AGEs treatment.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs AGEs（12 h）group；△△P＜0.01 vs AGEs（24 h）group.圖1 AGEs對HK-2細胞中KIM-1表達的影響

2 AGEs對HK-2細胞EMT和凋亡的影響

Western blot結果顯示，AGEs處理后，EMT標志蛋白α-SMA的表達呈時間依賴性升高（P＜0.05或P＜0.01），E-cadherin的表達呈時間依賴性降低（P＜0.05），見圖2A。MTS結果顯示，AGEs處理后，HK-2細胞活力呈時間依賴性降低（P＜0.01），見圖2B。流式細胞術結果顯示，AGEs處理后，HK-2細胞凋亡率呈時間依賴性升高（P＜0.01），見圖2C。以上結果表明，AGEs處理可促進HK-2細胞的EMT和凋亡。

3 轉染KIM-1 siRNA可降低AGEs處理后HK-2細胞中KIM-1的表達

Western blot和RT-qPCR結 果顯示，在AGEs處理后，與轉染NC siRNA的HK-2細胞相比，轉染KIM-1siRNA的HK-2細胞中KIM-1的蛋白和mRNA表 達均顯著降低（P＜0.01），見圖3。以上結果表明，KIM-1siRNA成功轉入細胞，且能顯著降低AGEs處理后HK-2細胞中KIM-1的表達。

4 敲減KIM-1可抑制AGEs誘導的HK-2細胞EMT和凋亡

Western blot結果顯示，與對照組相比，AGEs組和AGEs+NC siRNA組α-SMA蛋白表達顯著升高（P＜0.05），E-cadherin蛋白表達顯著降低（P＜0.01）；與AGEs+NC siRNA組相比，AGEs+KIM-1siRNA組α-SMA蛋白表達顯著降低（P＜0.05），E-cadherin蛋白表達顯著升高（P＜0.01），見圖4A。MTS結果顯示，與對照組相比，AGEs組和AGEs+NC siRNA組細胞活力顯著降低（P＜0.01）；與AGEs+NC siRNA組相比，AGEs+KIM-1siRNA組細胞活力顯著升高，見圖4B。流式細胞術和TUNEL染色結果顯示，與對照組相比，AGEs組和AGEs+NC siRNA組細胞凋亡率顯著升 高（P＜0.01）；與AGEs+NC siRNA組比，AGEs+KIM-1siRNA組細胞凋亡率顯著降低（P＜0.01），見圖4C、D。凋亡相關蛋白Western blot結果顯示，與對照組相比，AGEs組和AGEs+NC siRNA組Bcl-2蛋白表達顯著降低（P＜0.05），Bax和caspase-3蛋白表達顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）；與AGEs+NC siRNA組相比，AGEs+KIM-1siRNA組Bax和caspase-3蛋白表達顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），見圖4E。以上實驗結果表明，敲減KIM-1可抑制AGEs誘導的HK-2細胞EMT和凋亡。

Figure 2.Effect of AGEs on EMT and apoptosis of HK-2 cells.A：Western blot was used to detect the protein levels ofα-SMA and Ecadherin in HK-2 cells after AGEs treatment；B：MTS assay was used to measure the viability of HK-2 cells after AGEs treatment；C：flow cytometry was used to measure the apoptosis of HK-2 cells after AGEs treatment.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs AGEs（12 h）group；△P＜0.05，△△P＜0.01 vs AGEs（24 h）group.圖2 AGEs對HK-2細胞EMT和凋亡的影響

Figure 3.The protein（A）and mRNA（B）expression of KIM-1 was decreased after KIM-1 siRNA transfection in HK-2 cells.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs AGEs+NC siRNA group.圖3 轉染KIM-1 siRNA可降低AGEs處理后HK-2細胞中KIM-1的表達

Figure 4.Knockdown of KIM-1 suppressed AGEs-induced EMT and apoptosis of HK-2 cells.A：Western blot was used to detect the protein levels ofα-SMA and E-cadherin；B：MTS assay was used to measure the viability of HK-2 cells；C：flow cytometry was used to detect the apoptosis of HK-2 cells；D：TUNEL staining was used to detect the apoptosis of HK-2 cells；E：Western blot was used to detect the protein levels of Bcl-2，Bax and caspase-3.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs AGEs+NC siRNA group.圖4 敲減KIM-1可抑制AGEs誘導的HK-2細胞EMT和凋亡

5 敲減KIM-1可抑制AGEs誘導的HK-2細胞ROS產生和ERK通路激活

流式細胞術結果顯示，與對照組相比，AGEs組和AGEs+NC siRNA組HK-2細胞中ROS水平顯著升高（P＜0.01）；與AGEs+NC siRNA組相比，AGEs+KIM-1siRNA組HK-2細胞中ROS水平顯著降低（P＜0.01），見圖5A。Western blot結果顯示，與對照組相比，AGEs組和AGEs+NC siRNA組HK-2細胞ERK1/2蛋白的磷酸化水平顯著升高（P＜0.05）；與AGEs+NC siRNA組比，AGEs+KIM-1 siRNA組HK-2細胞ERK1/2蛋白的磷酸化水平顯著降低（P＜0.05），見圖5B。以上實驗結果表明，敲減KIM-1可抑制AGEs誘導的HK-2細胞ROS水平升高和ERK通路激活。

Figure 5.Knockdown of KIM-1 suppressed AGEs-induced ROS generation and activation of ERK signaling pathway in HK-2 cells.A：flow cytometry was used to detect the ROS levels in HK-2 cells；B：Western blot was used to detect the protein levels of p-ERK1/2 and ERK1/2.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs AGEs+NC siRNA group.圖5 敲減KIM-1可抑制AGEs誘導的HK-2細胞ROS產生和ERK通路激活

討 論

糖尿病是由多種原因引起的代謝紊亂綜合征，嚴重威脅人們的身體健康。DKD作為糖尿病常見的微血管并發癥之一，是我國住院患者慢性腎病的主要病因［8］。目前，對于DKD的易感因素仍不明確，導致終末期腎病進展的分子機制也不清楚。之前對于DKD的研究多以腎小球為研究對象，很少涉及腎小管間質。然而，越來越多的研究發現，相較于腎小球硬化，腎小管間質纖維化更能反應腎臟的損傷程度［2-4］。腎小管與尿液直接接觸，尿液中的糖、蛋白和AGEs等有物質均能引起腎小管上皮細胞結構和功能的改變，而持續的損傷又將引起細胞的凋亡，促進DKD進展為終末期腎病［4，9-10］。腎小管上皮細胞還可通過EMT過程參與細胞外基質的沉積和腎間質纖維化，而抑制細胞外基質的沉積和腎間質纖維化的發生則可減輕腎臟的損傷［11］。正因為腎小管上皮細胞在DKD的發生和發展中起著重要作用，因此控制其損傷或是抑制腎小管間質纖維化和DKD進展的中心環節。

AGEs是體內過量的葡萄糖等碳水化合物和蛋白質結合的產物，可引起糖尿病患者腎臟、視網膜血管和中樞神經系統細胞和組織的損傷［12］。從腎小球濾過的AGEs主要在近端小管被重吸收，因此近端小管是AGEs的重要作用部位［13］。AGEs可與其相應的受體結合，通過多種信號通路引起腎小管上皮細胞的損傷。研究發現，AGEs可通過ERK/p38-Smad3信號通路，促進結締組織生長因子在腎小管上皮細胞中的表達，引起腎小管間質纖維化［14］。AGEs還可以促進腎小管上皮細胞中TNF-α和IL-1β的表達，引起細胞損傷和炎癥反應［15］。AGEs作為DKD重要的致病因素之一，可通過調節JMJD1A/NR4A1信號通路等多種途徑影響EMT［5］。EMT是RIF時肌成纖維細胞的來源方式之一，其表現為腎小管上皮細胞出現α-SMA等間充質細胞的生物標志物，而E-cadherin等上皮細胞生物標志物表達降低。在本研究中，AGEs可使HK-2細胞EMT標志蛋白α-SMA表達呈時間依賴性升高，而E-cadherin蛋白表達呈時間依賴性降低。提示AGEs可引起HK-2細胞EMT。研究發現，腎小管上皮細胞凋亡可導致小管萎縮和功能障礙，是RIF的關鍵過程［4］。AGEs可通過激活ROS-JNK信號通路誘導神經細胞的凋亡［16］。在我們的研究中，發現AGEs可降低HK-2細胞的存活率，促進Bax和caspase-3蛋白表達增加，Bcl-2蛋白表達降低，增加細胞凋亡。總之，DKD發病機制非常復雜，其發生發展與AGEs有著密切的關系。因此研究AGEs對腎小管上皮細胞的影響及機制對于DKD的預防和治療，并延緩DKD進展具有重要的意義。

KIM-1是由受損的近端腎小管上皮細胞特異性表達的一種跨膜糖蛋白，在正常腎組織中幾乎不表達，而在各種急慢性腎損傷中特異且持續性地表達［17］。本課題組之前的研究發現，KIM-1在長期服用核苷酸類藥物致急性腎功能損傷的患者尿中表達顯著升高，可作為判斷腎臟損傷和疾病預后中敏感而又特異的標志物［18］。多項研究表明，KIM-1在糖尿病患者的尿液和腎組織中均表達升高，且其不僅可作為腎損傷的標志物，還參與了多種調節通路［4，19］。本研究發現，AGEs可誘導HK-2細胞KIM-1蛋白的表達呈時間依賴性升高，且KIM-1蛋白的表達與α-SMA蛋白的表達有相同的趨勢。KIM-1可介導棕櫚酸的白蛋白的吸收導致腎小管上皮細胞的凋亡，并且會誘導細胞內多種應激反應的出現，及TNF-α、IL-6和IL-1β等炎癥因子的產生，而這些應激反應又可共同驅動腎臟的纖維化［19］。在DKD發生過程中，KIM-1可通過激活TLR4/NF-κB信號通路，引起腎臟炎癥和纖維化［20］。有研究發現三聚氰胺可引起腎小管上皮細胞凋亡，同時KIM-1、金屬肽酶抑制劑1和TNF-α等腎損傷相關因子的表達顯著上調［21］。在本研究中，在轉染KIM-1siRNA可顯著抑制HK-2細胞的EMT和凋亡，表明KIM-1可參與AGEs誘導的HK-2細胞EMT和凋亡。

ERK信號通路作為哺乳類細胞中絲分裂原蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通路主要的分支路線之一，可參與細胞氧化應激、增殖和凋亡等多種病理生理過程［22］。氧化應激損傷是ROS連鎖反應引起的細胞毒性作用和生命大分子如膜脂質、蛋白質和DNA的損傷。研究發現，細胞內ROS在誘導腎小管上皮細胞的損傷中起關鍵作用，其可激活ERK的表達，導致EMT相關因子表達改變，最終導致腎纖維化［23］。尿蛋白可增加ROS水平并激活ERK信號通路，引起腎小管上皮細胞的損傷［9］。而在腎小管上皮細胞中過表達KIM-1后，同樣可引起ROS水平的提高［19］。在本研究中，AGEs可誘導HK-2細胞中ROS水平升高，并促進ERK1/2蛋白磷酸化。而敲減KIM-1可降低細胞中ROS水平，并抑制ERK1/2蛋白磷酸化。這些結果提示，KIM-1可能通過調節ROS水平和ERK通路的激活介導AGEs誘導的HK-2細胞EMT和凋亡。

綜上所述，AGEs能夠上調HK-2細胞中KIM-1的表達；敲減KIM-1可抑制AGEs誘導的HK-2細胞EMT和凋亡，其機制可能與降低ROS水平和抑制ERK通路激活有關。本研究揭示了KIM-1在DKD發病中的可能機制，為將KIM-1作為DKD防治靶點提供了實驗依據。然而，本研究僅通過單一刺激因素處理體外細胞，不能完全反映DKD狀態下體內復雜的變化過程，具有一定的局限性。因此，有待通過體內實驗進一步明確KIM-1在DKD中的作用和機制。