大葉秦艽總環烯醚萜苷3種提取工藝優化及其抗氧化活性研究

王 萍， 王宇鶴， 許 剛， 張瑞瑞， 廖予菲， 張夢娜， 賴普輝*

(1.陜西國際商貿學院，陜西 西安 712046；2.陜西省中藥綠色制造技術協同創新中心，陜西 西安 712046；3.西藏民族大學醫學部臨床醫院，陜西 咸陽 712082；4.陜西步長制藥有限公司，陜西 西安 710075)

大葉秦艽為陜西、甘肅道地藥材，也是商品秦艽的主要來源，其味辛、苦，性平，具有祛風濕、清濕熱、止痹痛、退虛熱功效[1]，含有環烯醚萜苷、黃酮、木脂素、多糖等成分[2]，其中環烯醚萜苷是龍膽屬植物特征化合物，也是秦艽活性成分之一，具有抗炎[3-5]、抗癌[6]、保肝[7-8]等作用。

目前，關于秦艽活性成分提取及抗氧化活性的文獻以總黃酮[9-10]、多酚[11]、熊果酸[12]為主，鮮有涉及環烯醚萜苷。因此，本實驗優化大葉秦艽回流提取、超聲提取、超聲-回流提取工藝，并考察其抗氧化活性，以期為后續該藥材品質研究、復方制劑開發利用提供理論依據。

1 材料

TU-1810型紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)；ME204型電子天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]；FW177型中草藥粉碎機(北京市永光明醫療儀器有限公司)；KQ-400DE型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；HH-S型水浴鍋(鞏義市英峪予華儀器廠)；DHG-9145A型電熱恒溫鼓風干燥箱(上海一恒科學實驗有限公司)；

龍膽苦苷對照品(DST200302-070，純度≥96%，德思特生物科技有限公司)；1,1-二苯基-2-三硝基苦基肼(純度≥96%，美國Sigma公司)；其余試劑均為分析純。

大葉秦艽采自陜西省寶雞市隴縣，經陜西國際商貿學院生藥教研室雷國蓮教授鑒定為龍膽科植物秦艽GentianamacrophyllaPall.的根。

2 方法

2.1 藥材預處理 大葉秦艽飲片粉碎后過40目篩，粉末，置于干燥器中保存。

2.2 總環烯醚萜苷含量測定

2.2.1 供試品溶液制備 精密稱取干燥至恒重的大葉秦艽粉末2 g，分別進行回流提取、超聲提取、超聲-回流提取，濾過，收集濾液，即得。

2.2.2 對照品溶液制備 精密稱取105 ℃干燥至恒重的龍膽苦苷對照品5.0 mg，置于25 mL量瓶中，甲醇定容，搖勻，即得(質量濃度為0.2 mg/mL)。

2.2.3 線性關系考察 參考文獻[13-14]報道并作適當修改。精密吸取對照品溶液0.25、0.50、0.75、1.0、1.25、1.50 mL至10 mL量瓶中，甲醇定容，搖勻，以甲醇為空白溶液，在272 nm波長處測定吸光度。以吸光度為縱坐標(A)，對照品質量濃度為橫坐標(X)進行回歸，得方程為A=24.338X-0.001 2(r=0.999 6)，在0.005～0.03 mg/mL范圍內呈良好的線性關系。

2.2.4 方法學考察

2.2.4.1 精密度試驗 精密吸取0.2 mg/mL對照品溶液1 mL，按“2.2.3”項下方法測定吸光度6次，測得其RSD為1.74%，表明儀器精密度良好。

2.2.4.2 重復性試驗 取大葉秦艽粉末2 g，按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液6份，按“2.2.3”項下方法測定吸光度，測得其RSD為1.51%，表明該方法重復性良好。

2.2.4.3 穩定性試驗 按“2.2.1”項下方法制備同一份供試品溶液，室溫下放置0、2、4、6、8、10 h后按“2.2.3”項下方法測定吸光度，測得其RSD為1.44%，表明溶液在10 h內穩定性良好。

2.2.4.4 加樣回收率試驗 取9份1.473 3 mg/mL提取液，每份0.25 mL，按50%、100%、150%水平加入0.2 mg/mL對照品溶液，甲醇定容至50 mL，按“2.2.3”項下方法測定吸光度，測得其平均加樣回收率分別為97.88%、98.83%、96.92%，RSD分別為1.51%、1.84%、1.41%。

2.3 提取工藝優化

2.3.1 回流提取工藝

2.3.1.1 單因素試驗 精密稱取大葉秦艽粉末2 g，考察乙醇體積分數(55%、65%、75%、85%、95%)、液料比(12∶1、16∶1、20∶1、24∶1、28∶1)、回流時間(30、60、90、120、150 min)、提取次數(1、2、3、4次)對總環烯醚萜苷含量的影響。

2.3.1.2 響應面法 在單因素試驗基礎上，以乙醇體積分數、液料比、提取次數、回流時間為影響因素，總環烯醚萜苷含量為評價指標進行優化。

2.3.2 超聲提取工藝

2.3.2.1 單因素試驗 精密稱取大葉秦艽粉末2 g，考察乙醇體積分數(55%、65%、75%、85%、95%)、液料比(12∶1、16∶1、20∶1、24∶1、28∶1)、超聲時間(20、30、40、50、60 min)、超聲功率(160、180、200、220、240 W)對總環烯醚萜苷含量的影響。

2.3.2.2 響應面法 在單因素試驗基礎上，以乙醇體積分數、液料比、超聲時間、超聲功率為影響因素，總環烯醚萜苷含量為評價指標進行優化。

2.3.3 超聲-回流提取工藝

2.3.3.1 單因素試驗 精密稱取大葉秦艽粉末2 g，考察乙醇體積分數(55%、65%、75%、85%、95%)、液料比(12∶1、16∶1、20∶1、24∶1、28∶1)、超聲時間(20、30、40、50、60 min)、回流時間(45、60、75、90、105 min)對總環烯醚萜苷含量的影響。

2.3.3.2 響應面法 在單因素試驗基礎上，以乙醇體積分數、液料比、超聲時間、回流時間為影響因素，總環烯醚萜苷含量為評價指標進行優化。

2.4 總環烯醚萜苷抗氧化活性研究

2.5 數據處理 實驗數據均測定3次，通過Design-Expert 8.0.6軟件進行響應面分析，Microsoft Excel 2007、Origin 8.0.6、SPSS 17.0軟件進行統計學分析。

3 結果

3.1 回流提取工藝優化

3.1.1 單因素試驗 見圖1，最終設定乙醇體積分數為65%～85%，液料比為16∶1～24∶1，回流時間為60～120 min，提取次數為1～3次，此時總環烯醚萜苷含量有最大值。

圖1 回流提取工藝中各因素對總環烯醚萜苷含量的影響

3.1.2 響應面法 因素水平見表1，結果見表2。

表1 回流提取工藝因素水平

表2 回流提取工藝設計與結果

對表2數據進行多元回歸分析，得方程為Y=61.77+0.27A+1.48B+3.00C+5.90D-2.82AB-0.89AC-0.038AD-0.14BC-2.96BD-1.37CD-4.06A2-3.83B2-4.42C2-7.56D2，方差分析見表3。由此可知，模型P<0.000 1，具有高度顯著性；失擬項P>0.05，表明模型擬合度良好；變異系數為4.44%，表明模型具有良好的精密度和可靠性；回流時間、提取次數對總環烯醚萜苷含量有極顯著影響(P<0.01)，液料比有顯著影響(P<0.05)，而乙醇體積分數無顯著影響(P>0.05)。

表3 回流提取工藝方差分析

響應面分析見圖2，可知最優工藝為乙醇體積分數74.80%，液料比20.24∶1，提取次數2.35次，回流時間98.58 min，考慮到操作可行性，將其修正為乙醇體積分數75%，液料比20∶1，提取次數2次，回流時間100 min，總環烯醚萜苷含量為63.29 mg/g。按上述優化工藝進行驗證試驗，測得總環烯醚萜苷平均含量為62.75 mg/g，與預測值63.29 mg/g接近，表明該工藝穩定可靠。

圖2 回流提取工藝中各因素響應面圖

3.2 超聲提取工藝優化

3.2.1 單因素試驗 見圖3，最終設定乙醇體積分數為65%～85%，液料比為16∶1～24∶1，超聲時間為30～50 min，超聲功率為180～220 W，此時總環烯醚萜苷含量有最大值。

圖3 超聲提取工藝中各因素對總環烯醚萜苷含量的影響

3.2.2 響應面法 因素水平見表4，結果見表5。

表4 超聲提取工藝因素水平

表5 超聲提取工藝設計與結果

對表5數據進行多元回歸分析，得方程為Y=69.60+1.81A+1.55B+1.83C+0.53D-1.94AB+0.72AC+1.06AD-0.79BC-1.51BD+3.24CD-3.88A2-2.53B2-5.65C2-3.15D2，方差分析見表6。由此可知，模型P<0.001，具有高度顯著性；失擬項P>0.05，表明模型擬合度良好；變異系數為3.36%，表明模型具有良好的精密度和可靠性；超聲時間對總環烯醚萜苷含量有極顯著影響(P<0.01)，乙醇體積分數、液料比有顯著影響(P<0.05)，而超聲功率無顯著影響(P>0.05)。

表6 超聲提取工藝方差分析

響應面分析見圖4，可知最優工藝為乙醇體積分數77.60%，液料比20.41∶1，超聲時間42.35 min，超聲功率204.51 W，考慮到操作可行性，將其修正為乙醇體積分數78%，液料比20∶1，超聲時間42 min，超聲功率204 W，總環烯醚萜苷含量為70.19 mg/g。按上述優化工藝進行驗證試驗，測得總環烯醚萜苷平均含量為70.25 mg/g，與預測值70.19 mg/g接近，表明該工藝穩定可靠。

圖4 超聲提取工藝中各因素響應面圖

3.3 超聲-回流提取工藝優化

3.3.1 單因素試驗 見圖5，最終設定乙醇體積分數為65%～85%，液料比為12∶1～20∶1，超聲時間為20～40 min，回流時間為60～90 min，此時總環烯醚萜苷含量有最大值。

圖5 超聲-回流提取工藝中各因素對總環烯醚萜苷含量的影響

3.3.2 響應面法 因素水平見表7，結果見表8。

表7 超聲-回流提取工藝因素水平

表8 超聲-回流提取工藝試驗與結果

對表8數據進行多元回歸分析，得方程為Y=77.16-0.15A+0.93B-1.22C-2.79D+2.28AB+0.077AC-0.88AD+1.98BC+0.077BD+1.45CD-1.47A2-3.05B2-6.15C2-9.13D2，方差分析見表9。由此可知，模型P<0.000 1，具有高度顯著性；失擬項P>0.05，表明模型擬合度良好；變異系數為2.21%，表明模型具有良好的精密度和可靠性；回流時間對總環烯醚萜苷含量有極顯著影響(P<0.01)，液料比、超聲時間顯著影響(P<0.05)，而乙醇體積分數無顯著影響(P>0.05)。

表9 超聲-回流提取工藝方差分析

響應面分析見圖6，可知最優工藝為乙醇體積分數76.46%，液料比16.72∶1，超聲時間29.10 min，回流時間72.48 min，總環烯醚萜苷含量為77.55 mg/g，考慮到操作可行性，將其修正為乙醇體積分數76%，液料比17∶1，超聲時間29 min，回流時間72 min。按上述優化工藝進行驗證試驗，測得總環烯醚萜苷平均含量為76.49 mg/g，與預測值77.55 mg/g接近，表明該工藝穩定可靠。

圖6 超聲-回流提取工藝中各因素響應面圖

3.4 驗證試驗 稱取大葉秦艽粉末適量，分別按3種優化工藝進行3批驗證試驗，結果見表10，可知超聲-回流提取工藝所得總環烯醚萜苷含量最高。

表10 驗證試驗結果(n=3)

3.5 抗氧化活性研究 圖7顯示，3種提取工藝所得提取物清除DPPH、OH-自由基能力均與其質量濃度成正比，其中對前者清除率的IC50分別為2.251、2.245、1.752 mg/mL，對后者清除率的IC50分別為2.871、2.701、2.234 mg/mL，可知超聲-回流提取工藝所得提取物的抗氧化活性最強。

圖7 提取物對各自由基的清除率

4 討論

環烯醚萜類成分是秦艽中含量最高的成分之一，也是其標志化合物。預實驗比較了秦艽粉末提取溶劑，發現水提液中總環烯醚萜苷含量明顯低于醇提液中，故本實驗選擇乙醇作為提取溶劑。

響應面法對試驗數據進行建模，并可連續地對試驗因素的各個水平分析，從而避免了正交試驗精密度不高、預測性不好的缺陷，故本實驗采用該方法優化大葉秦艽總環烯醚萜苷3種提取工藝，發現采用超聲-回流提取法時該成分含量明顯高于回流提取、超聲提取，而且該方法操作簡單，合理可行。

抗氧化活性實驗結果顯示，大葉秦艽總環烯醚萜苷質量濃度為1～4 mg/mL時，其還原能力逐漸增強，與文獻[19-20]報道一致；為4 mg/mL時，超聲-回流提取的總環烯醚萜苷對DPPH、OH-自由基的清除率分別達(79.75±0.78)%、(75.16±0.64)%，遠高于其他2種提取方法。今后，將重點考察大葉秦艽總環烯醚萜苷提取物質量濃度與其抗氧化活性的相關性。