芩柏湯通過調節TLR2/IκB-α/IL-1β通路保護潰瘍性結腸炎大鼠腸黏膜的研究

劉 雯， 侯晨輝， 李 江

(1.鄭州鐵路職業技術學院護理學院，河南 鄭州 451460；2.河南省天然藥物提取和醫療技術應用工程研究中心，河南 鄭州 451460)

潰瘍性結腸炎是一種臨床常見的慢性非特異性炎癥性疾病，我國患病率約為1/10 000[1]，在潰瘍性結腸炎患者中，約46%的患者表現為慢性復發型，病情反復，遷延難愈[2]。近年來中醫藥治療潰瘍性結腸炎的研究得到了長足的進展，其優勢也逐漸被認可[3-4]。芩柏湯是根據芩柏顆粒組方加減所得的中藥湯劑，可清熱燥濕、活血化瘀、潤腸通便，有研究顯示芩柏湯治療潰瘍性結腸炎有確切效果，可保護結腸黏膜[5]。Toll樣受體2(TLR2)可通過細胞膜外區富含亮氨酸的重組序列識別配體，進而激活相關接頭蛋白，上調核轉錄因子-κB(NF-κB)的表達，與此同時核因子κB抑制蛋白-α(IκB-α)磷酸化水平升高，可解離NF-κB的復合物，誘導基因轉錄，產生持續擴大的炎癥反應，并增加白介素-1β(IL-1β)表達[6-7]。有研究顯示，抑制TLR2/IκB-α/IL-1β通路中TLR2、NF-κB、IκB-α、IL-1β表達可降低血清IL-1β、IL-4水平，升高IL-10水平，減輕炎癥反應，保護潰瘍性結腸炎模型的腸黏膜[8-10]。因此，本展開了對芩柏湯保護潰瘍性結腸炎大鼠腸黏膜的機制研究。

1 材料

1.1 動物 54只清潔級SD成年大鼠，7～9周齡，雌雄各半，體質量184～226 g，購自上海加科生物科技有限公司，實驗動物生產許可證號SCXK(滬)2020-0001。大鼠飼養于河南中醫藥大學醫學實驗動物中心，自由飲食(標準飼料)與進水(高壓滅菌水)，溫度20～25 ℃，相對濕度40%～60%，12 h光照/12 h黑暗，適應性喂養1周。參照3R原則設計實驗，本實驗已經河南省實驗動物醫學倫理委員會審批通過[(準字)R201902-003]。

1.2 試劑與藥物 美沙拉嗪(葵花藥業集團佳木斯鹿靈制藥有限公司，批號190516)；芩柏湯藥材(廣東省惠州市中藥廠有限公司，經河南中醫藥大學紀寶玉副教授鑒定合格)。大鼠血清IL-1β、IL-4、IL-10酶聯免疫法(ELISA)檢測試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，批號20200710A、20200412C、20200318A)；蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(上海西唐生物科技有限公司，批號200613)；TRIzol試劑(北京萊博潤科生物科技有限公司，貨號R20200127)；兔抗鼠TLR2、IκB-α、NF-κB、IL-1β、p-IκB-α單抗，羊抗兔TLR2、IκB-α、NF-κB、IL-1β、p-IκB-α多抗(英國Abcam公司，批號20200113、20200221、20200117、20200312、20200514，20200226、20200126、20200415、20200412、20200511)。三硝基苯磺酸(TNBS)(北京譜朋科技有限公司，貨號200111)；無水乙醇(貨號G20200418)。

1.3 儀器 2164型超凈工作臺(美國BioX科技有限公司)；LC-2030型高效液相色譜儀(日本島津公司)；硅膠管(東莞泰同實業有限公司)；AB126型大鼠保溫燈(北京中西遠大科技有限公司)；BH2-UMA型光學顯微鏡(日本Olympus公司)；T100型聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)儀、Turbo型轉膜儀(美國Bio-Rad公司)；Mixer型勻漿儀(美國OMNI公司)；NanoDrop型超微量紫外線分光光度計(美國Thermo公司)；LKB2050型蛋白質電泳儀(瑞典pharmacia LKB公司)；PHOTOCHEM型化學發光儀(德國耶拿分析儀器股份有限公司)。

2 方法

2.1 芩柏湯制備 稱取黨參、炒白術、生黃芪各20 g，當歸、丹參各12 g，黃芩、黃柏、秦艽、防風、澤瀉、制大黃、玄胡各10 g，桃仁6 g，加水浸泡30 min，煎煮30 min，取200 mL煎煮液，同法再次煎煮取200 mL煎煮液，混勻后過濾，水浴加熱濃縮至每1 mL含1 g生藥。

2.2 造模、分組與給藥 將54只SD大鼠隨機分為2組，其中9只記為正常組，余45只采用TNBS/乙醇聯合法建立潰瘍性結腸炎大鼠模型[11]，造模前禁食不禁水24 h，取5% TNBS與無水乙醇1∶1混合，10%水合氯醛3.5 mL/kg腹腔注射麻醉，取經過石蠟油潤滑的硅膠管(長約12 cm，直徑2.0 mm)，經肛門輕插入大鼠體內約8 cm，將上述混合液按照100 mg/kg劑量經硅膠管注入，正常組同法注入等量生理鹽水，均提起尾部倒置10 min后仰臥歸籠，保溫燈照射至大鼠自然蘇醒。3 d后于造模大鼠中隨機取1只頸椎脫臼法處死，經病理檢查確認是否造模成功。將剩余造模大鼠按隨機數字表法分為5組，即模型組，美沙拉嗪組，芩柏湯低、中、高劑量組。美沙拉嗪組予以5%美沙拉嗪混懸液2 mL灌腸，芩柏湯低、中、高劑量組予以6%、12%、24%芩柏湯混懸液2 mL灌腸，模型組和正常組予以蒸餾水2 mL灌腸，每天2次，共給藥3周。

2.3 疾病活動指數(DAI)評價大鼠一般情況 將體質量下降率<1%、≥1%且<5%、≥5%且<10%、≥10%分別評為0、1、2、3分；將大便性狀正常、略松散、松散、腹瀉分別評為0、1、2、3分；將大便正常、隱血陽性、肉眼出血、血便分別評為0、1、2、3分，計算上述3項評分總和，得分越高認為病情越嚴重[12]。

2.4 Luk評分評價大鼠結腸病變 脊椎脫臼法處死大鼠，取結腸剪開并以生理鹽水沖洗，腸黏膜層向上平鋪，觀察其色澤、充血、糜爛及潰瘍等情況。將無損傷、充血且無潰瘍，充血且腸壁增厚但無潰瘍，有1處潰瘍但無腸壁增厚，有2處或以上潰瘍/炎癥，有2處或以上大潰瘍和炎癥，有1處潰瘍/炎癥沿結腸縱軸>1 cm分別評為0、1、2、3、4、5分；若沿腸縱軸損傷>2 cm，每超過1 cm增加1分(6～10分)[13]。

2.5 ELISA法檢測血清炎癥因子水平 取大鼠尾靜脈血，3 500 r/min離心15 min(離心半徑8 cm)，取上清液采用ELISA試劑盒檢測血清IL-1β、IL-4、IL-10水平。

2.6 HE染色觀察結腸黏膜病理變化 取大鼠結腸黏膜組織，中性甲醛固定，梯度乙醇脫水后透明、包埋，連續切片(5 μm)，蘇木素染色，伊紅復染，脫水，透明，中性樹膠封片后高倍光鏡下觀察。

2.7 RT-qPCR法檢測結腸黏膜TLR2/IκB-α/IL-1β通路相關基因mRNA表達 取大鼠結腸黏膜組織研磨勻漿，TRIzol法提取總RNA，采用超微量紫外線分光光度計定量后將其逆轉錄為cDNA，以其作為模板擴增。擴增反應條件為95 ℃ 30 s；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，循環40次；最后54 ℃ 10 min。采用2-ΔΔCT法計算TLR2、NF-κB、IκB-α、IL-1βmRNA相對表達。引物序列委托寶生物工程(大連)有限公司合成，具體信息見表1。

表1 引物信息

2.8 Western blot法檢測結腸黏膜TLR2/IκB-α/IL-1β通路相關蛋白表達 取大鼠結腸黏膜組織提取總蛋白并定量，取50 μg上樣，SDS-PAGE電泳，轉膜，封閉1 h，加一抗(1∶1 000)4 ℃孵育過夜，加二抗(1∶5 000)室溫孵育1 h，暗室加發光劑，曝光后采用化學發光儀成像，并采用IPP6.0圖像分析軟件分析蛋白相對表達量及磷酸化水平。胞核NF-κB蛋白表達檢測內參為H3，TLR2、IκB-α、胞漿NF-κB、IL-1β、p-IκB-α蛋白表達檢測內參為GAPDH。

3 結果

3.1 潰瘍性結腸炎大鼠結腸組織病理情況 造模大鼠結腸黏膜及其下層有充血、水腫、大量炎性細胞浸潤等現象，符合潰瘍性結腸炎典型病理表現，見圖1。

3.2 芩柏湯對潰瘍性結腸炎大鼠DAI、Luk評分的影響 給藥前后與正常組比較，各組大鼠DAI評分均升高(P<0.01)。給藥后與正常組比較，模型組大鼠DAI、Luk評分均升高(P<0.01)；與模型組比較，美沙拉嗪組和芩柏湯各劑量組DAI、Luk評分均降低(P<0.01)；與美沙拉嗪組比較，芩柏湯中、高劑量組DAI、Luk評分均降低(P<0.01)，見表2。

注：A為肉眼觀察結腸，B為結腸HE染色(×400，標尺50 μm)。藍色箭頭指示結腸黏膜水腫，紅色箭頭指示黏膜下層充血水腫、炎性細胞浸潤。

表2 各組大鼠DAI、Luk評分比較(分,

3.3 芩柏湯對潰瘍性結腸炎大鼠血清炎癥因子水平的影響 給藥前后與正常組比較，模型組大鼠血清IL-1β、IL-4水平均升高(P<0.01)，血清IL-10水平均降低(P<0.01)；給藥后與模型組比較，美沙拉嗪組和芩柏湯各劑量組血清IL-1β、IL-4水平均降低(P<0.01)，血清IL-10水平均升高(P<0.01)，見表3。

表3 各組大鼠給藥前后血清炎癥因子水平比較

3.4 芩柏湯對潰瘍性結腸炎大鼠結腸黏膜組織病理變化的影響 正常組大鼠結腸黏膜組織可見黏膜全層結構和血管紋理清晰，腺體規則排列，上皮細胞整齊緊密，杯狀細胞豐富；模型組可見黏膜及其下層大量炎性細胞浸潤，上皮細胞排列稀疏，大量腺體破壞，杯狀細胞極少，有肉芽組織形成，且有嚴重充血、水腫、糜爛和潰瘍表現；美沙拉嗪組和芩柏湯低劑量組可見部分炎性細胞浸潤，組織有充血水腫，可見少量糜爛及潰瘍；芩柏湯中劑量組可見少部分炎性細胞浸潤，上皮細胞排列整齊，有充血、水腫；芩柏湯高劑量組可見極少炎性細胞浸潤，上皮細胞排列整齊緊密，杯狀細胞豐富，有輕微充血、水腫，見圖2。

圖2 各組大鼠結腸黏膜組織病理變化(HE染色，×400，標尺50 μm)

3.5 芩柏湯對潰瘍性結腸炎大鼠結腸黏膜組織TLR2、NF-κB、IκB-α、IL-1βmRNA表達的影響 與正常組比較，模型組大鼠結腸黏膜組織TLR2、NF-κB、IκB-α、IL-1βmRNA表達均升高(P<0.01)；與模型組比較，美沙拉嗪組和芩柏湯各劑量組結腸黏膜組織以上指標mRNA表達均降低(P<0.01)；與美沙拉嗪組比較，芩柏湯中、高劑量組結腸黏膜組織以上指標mRNA表達均降低(P<0.01)，見表4。

3.6 芩柏湯對潰瘍性結腸炎大鼠結腸黏膜組織TLR2/IκB-α/IL-1β通路相關蛋白表達的影響 與正常組比較，模型組大鼠結腸黏膜組織TLR2、IκB-α、胞核NF-κB、IL-1β、p-IκB-α蛋白表達均升高(P<0.01)，p-IκB-α/IκB-α蛋白表達比值與胞漿NF-κB蛋白表達均降低(P<0.01)；與模型組比較，美沙拉嗪組和芩柏湯各劑量組結腸黏膜組織TLR2、IκB-α、胞核NF-κB、IL-1β、p-IκB-α蛋白表達均降低(P<0.01)，胞漿NF-κB均升高(P<0.01)，芩柏湯中、高劑量組p-IκB-α/IκB-α蛋白表達比值均升高(P<0.05，P<0.01)，見圖3～4、表5。

表4 各組大鼠結腸黏膜組織TLR2、NF-κB、IκB-α、IL-1β mRNA表達比較

圖3 各組大鼠結腸黏膜組織TLR2、IκB-α、胞漿NF-κB、IL-1β、p-IκB-α蛋白表達

圖4 各組大鼠結腸黏膜組織胞核NF-κB蛋白表達

4 討論

美沙拉嗪屬于柳氮磺胺砒啶治療潰瘍性結腸炎的活性成分，因此本研究選用其作為對照藥物[14]，但其僅對輕中度潰瘍性結腸炎患者有效[15]。中醫將潰瘍性結腸炎歸屬于“泄瀉”“腸癖”范疇，脾氣虛弱，濕邪旺盛，濕蘊化熱，血分受累，及肝腎，易致血瘀[16]；腸癖多因氣虛夾濕、氣血瘀滯、久病入絡，則病程蔓延，遷延難愈，形成“虛中有實”“虛實夾雜”之癥[17]。因針對此類病癥應以健脾益氣、補虛祛濕為重，兼活血祛瘀。

表5 各組大鼠結腸黏膜組織TLR2/IκB-α/IL-1β通路相關蛋白表達比較

本研究發現美沙拉嗪和芩柏湯均可改善潰瘍性結腸炎大鼠的一般狀況，減輕結腸黏膜病理改變和炎癥反應。芩柏湯中黨參健脾益氣、生津潤燥，將黨參、黃芪合用益氣扶正、托毒外出；白術甘溫補中、溫苦燥濕，兼具益氣補脾、行水燥濕之效；黃芩、黃柏合用清熱燥濕、祛火解毒；丹參活血化瘀、行氣祛瘀；以玄胡、防風、秦艽、澤瀉佐之，玄胡行氣活血，防風祛風止痛，秦艽勝濕健脾，澤瀉利水滲濕；大黃為使藥，瀉火解毒、導熱外出、涼血祛瘀。諸藥合用，共奏健脾補虛、祛瘀除濕之效。此外，黨參可抗潰瘍，修復受損的腸黏膜，還可減輕炎癥反應[18]；黃芪可調節機體體液和細胞免疫，降低血清促炎因子水平，改善腸黏膜功能[19]。因此芩柏湯治療潰瘍性結腸炎有確切效果。

目前TLRs介導的免疫信號轉導效應在潰瘍性結腸炎發生發展中得到了廣泛關注[20-21]。TLR2可識別配體，導致IκB-α被激活，調控NF-κB轉錄[22-24]。Bank等[25]證實抑制TLR2表達可減輕潰瘍性結腸炎大鼠結腸黏膜組織炎癥浸潤。IκB-α，發生磷酸化進而從NF-κB中解離，NF-κB暴露核定位點，使得胞漿中的NF-κB迅速向細胞核移位，誘導基因轉錄，增加IL-1β表達。過量的TLR2可導致NF-κB過度激活，產生持續擴大的炎癥反應，使得促炎癥細胞因子IL-1β、IL-4水平增加，而IL-10水平降低[26-27]，本研究結果與上述報道相符。本研究發現，模型組IκB-α、p-IκB-α蛋白表達均較正常組升高，而p-IκB-α/IκB-α較正常組降低，與上述趨勢相反，可能是因為潰瘍性結腸炎大鼠結腸黏膜組織在發生炎癥反應同時，可能也存在拮抗炎癥的自我保護作用。本研究還發現，中、高劑量芩柏湯可降低p-IκB-α表達，下調胞核NF-κB蛋白表達，增加胞漿NF-κB蛋白表達，減輕炎癥反應，可能是通過抑制該通路減輕潰瘍性結腸炎大鼠結腸黏膜炎癥反應和病理損傷。

綜上所述，美沙拉嗪和芩柏湯均可減輕潰瘍性結腸炎大鼠結腸黏膜病變和炎癥反應，且中、高劑量芩柏湯的效果優于美沙拉嗪，推測該方劑可能是通過抑制TLR2/IκB-α/IL-1β通路減輕炎癥反應。