姜黃素對臍帶間充質干細胞脂毒性損傷及生物功能的影響

羅瑞熙， 趙立鳳， 李帥帥

(貴州中醫藥大學，貴州 貴陽 550025)

間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一種具有多向分化潛能的干細胞，具有免疫調節、組織損傷修復的功能[1]，有一定的臨床應用前景[2]。課題組前期研究顯示，MSCs可以減輕高脂飼料誘導的大鼠脂代謝紊亂及早期主動脈內膜增厚現象；還可以通過抑制內質網應激途徑減輕人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)脂毒性損傷[3]。當MSCs長期處于高脂、高糖、炎性、缺氧等微環境下，會損傷細胞存活率和功能，進而降低MSCs的治療效果[4]。

目前，中藥復方及單體成分對MSCs功能的改善逐步成為研究熱點[5]。姜黃素是從姜科姜黃屬植物姜黃、郁金、莪術的干燥根莖中提取的一種天然有效成分[6]，具有抗炎、抗氧化、調脂、抗病毒、抗感染、抗腫瘤、抗凝、抗肝纖維化等藥理活性，而且毒性低，不良反應小[7]。研究表明，姜黃素可通過調節Akt/ERK通路改善線粒體功能來減輕H2O2誘導的大鼠MSCs氧化應激損傷[8]；通過調節TERT通路促進大鼠MSCs增殖，延緩MSCs衰老[9]，但是否可通過抑制內質網應激途徑減輕高脂環境下MSCs脂毒性損傷尚不明確。因此，本研究擬建立棕櫚酸誘導的MSCs脂毒性損傷模型，以內質網應激為切入點，探討姜黃素對MSCs脂毒性損傷的調節作用，同時觀察其干預是否有助于提高MSCs對HUVECs的保護作用，為相關臨床應用提供實驗基礎。

1 材料

1.1 細胞 人臍帶間充質干細胞(MSCs)和人原代臍靜脈內皮細胞(HUVECs)購自美國ScienCell公司。

1.2 試劑與藥物 姜黃素(美國Selleck公司，貨號S1848，純度99.83%)。DMEM低糖培養基、胎牛血清(美國Gibco公司，批號12320032、10091148)；ECM內皮細胞培養基(美國ScienCell公司，貨號1001)；棕櫚酸[愛必信(上海)生物科技有限公司，貨號abs47001260]；AccutaseTM細胞消化液(美國eBioscience公司，批號00-4555-56)；CCK-8細胞活性檢測試劑盒(日本同仁化學研究所，貨號CK04)；油紅O染色試劑盒、4%組織細胞固定液、牛血清白蛋白BSA、RIPA細胞高效裂解液、10×TBST緩沖液(北京索萊寶科技有限公司，貨號G1262、P1110、A8850、R0010、T1081)；甘油三酯(TG)檢測試劑盒(美國Abnova公司，貨號K622-100)；TRIzolTMReagent(美國Ambion公司，批號15596026)；5×qRT SuperMix、2×SYBR Green qPCR Master Mix、C/EBP 同源蛋白(C/EBP-homologous protein，CHOP)抗體(美國Bimake公司，貨號JW20、B21202、A5462)；BCA蛋白定量試劑盒、10% PAGE凝膠快速制備試劑盒、蛋白酶抑制劑混合液、蛋白上樣緩沖液、三色預染蛋白Marker、0.22 μm PVDF膜、快速轉膜緩沖液(上海雅酶生物科技有限公司，貨號ZJ102、PG112、GRF101、LT103、WJ103、WJ001、PS101S)；脫脂奶粉(北京博奧拓達科技有限公司，批號232100)；免疫球蛋白重鏈結合蛋白(binding immunoglobulin protein，BiP)抗體(武漢三鷹生物技術有限公司，貨號11587-1-AP)；β-actin抗體(武漢愛博泰克生物科技有限公司，貨號AC026)；辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗(北京中杉金橋生物技術有限公司，貨號ZB-2301)；超敏ECL化學發光試劑盒(美國Thermo公司，貨號32209)。甲醇、異丙醇、無水乙醇均為分析純(天津市科密歐化學試劑有限公司)。

1.3 儀器 CO2細胞培養箱(美國Sanvall公司)；超凈工作臺(美國Nuaire公司)；全自動多功能酶標儀、熒光分光光度計(美國Thermo公司)；低溫離心機(德國Beckman公司)；Transwell共培養小室、超純水系統(美國Milipore公司)；高壓滅菌鍋(德國Systec公司)；倒置相差顯微鏡(德國Leica公司)；PCR擴增儀、熒光定量PCR儀、蛋白凝膠電泳儀、凝膠成像系統(美國Bio-Rad公司)；超低溫冰箱(日本三洋公司)。

2 方法

2.1 細胞培養 MSCs用含10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM低糖培養基培養，HUVECs用ECM內皮專用培養基培養，均置于37 ℃、5% CO2培養箱中孵育。待細胞生長至80%融合度時進行傳代，取對數生長期者用于實驗。在共培養實驗下，MSCs種于Traswell小室上層，HUVECs種于6孔板培養皿底部，兩者初始細胞比例為1∶5，共培養培養基采用ECM，除部分RT-qPCR相關實驗外，共培養時間為24 h。

2.2 分組及給藥 MSCs細胞分為4組，分別為正常組、姜黃素組、棕櫚酸(200 μmol/L)組、棕櫚酸(200 μmol/L)+姜黃素(5 μmol/L)組，加藥干預以探究黃素干預對MSCs脂毒性損傷及生物功能的影響；HUVECs細胞分為4組，分別為正常組、棕櫚酸(50 μmol/L)組、棕櫚酸(50 μmol/L)+MSCs(200 μmol/L棕櫚酸預處理24 h)組、棕櫚酸(50 μmol/L)+MSCs(200 μmol/L棕櫚酸+5 μmol/L姜黃素預處理24 h)組，MSCs與HUVECs共培養以探究姜黃素預處理對MSCs提高HUVECs活性的影響。

2.3 細胞活性檢測 細胞以每孔8 000個的密度接種于96孔板，按“2.1”“2.2”項下方法分組、培養和給藥，培養24 h后吸棄培養基，PBS清洗1次，加入100 μL CCK8工作液，在37 ℃下孵育2～6 h后, 采用酶標儀在450 nm波長處檢測光密度(OD)值，計算細胞相對活性。

2.4 油紅O染色 細胞接種于6孔板，按“2.1”“2.2”項下方法分組、培養、給藥，培養24 h后吸棄培養基，PBS清洗1次，10%中性甲醛固定10 min，吸棄中性甲醛固定液，PBS清洗3次，取油紅O工作液1 mL加入6孔板中，室溫染色30 min，吸棄染液，60%異丙醇漂洗后PBS清洗3次，蘇木素復染后PBS清洗3次，在倒置顯微鏡下觀察并拍照采集圖像。

2.5 細胞TG水平檢測 細胞接種于6孔板，按“2.1”“2.2”項下方法分組、培養、給藥，培養24 h后將各組細胞數矯正為一致，每孔加入100 μL脂質提取緩沖液，蓋上孔板蓋并用封口膜密封，置于90～100 ℃烘箱中孵育30 min，當液體呈現渾濁時將孔板取出，并降溫至室溫，振蕩1 min混勻液體，吸取50 μL加到96孔板上，每孔加入2 μL脂肪酶溶液，室溫靜置10 min，按照每孔2 μL探針、2 μL酶混合液、46 μL稀釋緩沖液的比例配制反應液，并加入相應孔中，室溫避光孵育30 min，采用酶標儀在570 nm波長處檢測OD值，根據標準曲線計算各組細胞TG水平。

2.6 RT-qPCR法檢測BiP、CHOP、XBP1 mRNA表達 細胞接種于6孔板，按“2.1”“2.2”項下方法分組、培養、給藥，培養12 h后收集細胞，TRIzol法提取總RNA并逆轉錄為cDNA，采用Bio-Rad熒光定量PCR儀進行RT-qPCR反應，反應條件為預變性95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 1 min，共39個循環；熔解曲線反應條件為65～95 ℃ 10 s (每0.5 ℃梯度檢測)。結果采用2-ΔΔCT相對定量法分析。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，序列見表1。

表1 引物序列

2.7 Western blot法檢測BiP、CHOP蛋白表達 細胞接種于6孔板，按“2.1”“2.2”項下方法分組、培養、給藥，收集細胞，加入含1% PMSF的RIPA細胞裂解液裂解細胞，BCA蛋白濃度試劑盒檢測蛋白濃度后在-80 ℃下保存備用。蛋白經SDS-PAGE凝膠電泳分離后轉移至PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉1 h，加入一抗4 ℃孵育過夜，PBST洗膜3次，每次5 min，加入二抗(1∶5 000)，37 ℃搖床上孵育1 h，PBST洗膜3次，每次5 min，ECL顯影發光液輕微沖洗，置于凝膠成像儀中進行曝光，采用Image J pro軟件進行灰度分析，以β-actin為內參，計算蛋白相對表達。

3 結果

3.1 姜黃素減輕棕櫚酸誘導的MSCs活性損傷 姜黃素在5 μmol/L濃度以下對MSCs無毒性作用，見表2。棕櫚酸刺激MSCs 24 h后，對細胞的毒性作用呈劑量依賴性，見表3，故選取200 μmol/L棕櫚酸刺激24 h建立MSCs脂毒性損傷模型。如表4所示，棕櫚酸刺激后MSCs細胞活性降低約22%，而5 μmol/L姜黃素干預后細胞活性恢復至94%，提示姜黃素可改善棕櫚酸對MSCs細胞活性的抑制作用。

表2 姜黃素對MSCs細胞活性的影響

表3 棕櫚酸對MSCs細胞活性的影響

表4 姜黃素對棕櫚酸誘導的MSCs損傷細胞活性的影響

3.2 姜黃素減輕棕櫚酸誘導的MSCs脂質沉積 脂質沉積是棕櫚酸誘導MSCs脂毒性損傷的主要表現之一。如表5、圖1所示，正常組和姜黃素組均無明顯脂滴沉積；棕櫚酸刺激24 h能誘導MSCs脂質沉積增加，升高TG水平(P<0.05)；姜黃素干預后能減少細胞脂質沉積，降低TG水平(P<0.05)，提示姜黃素可減少棕櫚酸誘導的MSCs胞內脂質沉積。

表5 姜黃素對棕櫚酸誘導的MSCs細胞TG水平的影響

圖1 各組細胞脂質沉積(×200)

3.3 姜黃素減輕棕櫚酸誘導的MSCs內質網應激 如表6所示，棕櫚酸刺激MSCs 12 h后，內質網應激相關基因BiP、CHOP、XBP1 mRNA表達均升高(P<0.05)，而5 μmol/L姜黃素干預后BiP、CHOP、XBP1 mRNA表達降低(P<0.05)。如圖2、表7所示，與正常組比較，棕櫚酸組內質網應激早期標志蛋白BiP和晚期標志蛋白CHOP表達均升高(P<0.05)；與棕櫚酸組比較，姜黃素干預后BiP、CHOP蛋白表達降低(P<0.05)。如圖3、表8所示，姜黃素單用對BiP、CHOP蛋白表達無明顯影響(P>0.05)。以上結果提示，姜黃素可減輕棕櫚酸誘導的MSCs 內質網應激。

表6 姜黃素對棕櫚酸誘導的MSCs細胞BiP、CHOP、XBP1 mRNA表達的影響

圖2 各組細胞BiP、CHOP的蛋白表達

圖3 姜黃素干預后MSCs細胞BiP、CHOP蛋白表達

3.4 姜黃素預處理提高MSCs對HUVECs脂毒性損傷的保護作用 如表9所示，與正常組比較，棕櫚酸誘導HUVECs 24 h后細胞活性降低約50%；與棕櫚酸組比較，MSCs(棕櫚酸預處理)組HUVECs活性提高至67%左右，而MSCs(棕櫚酸+姜黃素預處理)組HUVECs活性進一步提高至89%左右，提示姜黃素對MSCs的脂毒性損傷保護作用有助于提高其對HUVECs脂毒性損傷的保護。

表7 姜黃素對棕櫚酸誘導的MSCs細胞BiP、CHOP蛋白表達的影響

表8 姜黃素對MSCs細胞BiP、CHOP蛋白表達的影響

4 討論

近年來，許多研究報道中藥可通過改善MSCs細胞活性及功能從而提高MSCs治療效果[10-11]。中藥對MSCs損傷的保護作用已被廣泛報道[12]，其中姜黃素因其抗炎、抗氧化、調脂等特性成為了近期研究熱點之一。姜黃素可通過減輕MSCs衰老從而提高MSCs生物活性[9]；Ruzicka等[13]報道了姜黃素和MSCs對脊髓炎癥損傷具有協同干預作用；Attari 等[14]研究表明姜黃素可以提高MSCs活性，然而對神經干細胞活性并無影響作用。因此，本研究探索了姜黃素是否對棕櫚酸誘導的MSCs細胞活性損傷具有保護作用，結果提示姜黃素可提高MSCs細胞活性。然而，在過量的游離脂肪酸刺激MSCs引起的脂毒性損傷過程中，其損傷機制與炎性損傷明顯不同，因此本研究進一步對姜黃素是通過何種途徑干預MSCs脂毒性損傷進行了探索。

表9 姜黃素預處理MSCs細胞對其干預棕櫚酸誘導的HUVECs細胞活性的影響

脂毒性損傷一般指異常的脂質累積而誘發的細胞損傷。目前認為，飽和脂肪酸誘發細胞脂毒性損傷的主要機制包括內質網應激途徑、ROS途徑、溶酶體途徑、c-JUN激酶途徑、過量神經酰胺生成等[15]，其中內質網應激誘導的細胞損傷是最近研究被認為最重要的途徑之一。BiP是主要的內質網分子伴侶，協助蛋白質折疊及裝配，降解錯誤折疊的蛋白，維持內質網的穩態和控制內質網應激傳感器的激活，是細胞維持正常功能的重要調節蛋白。當內質網腔內未折疊蛋白增加時，BiP變為游離狀態，早期BiP的解離有助于恢復蛋白質的正確構象，是內質網應激早期的標志蛋白之一[16]。CHOP是內質網應激特異的促凋亡因子，通過基因轉錄調控啟動下游凋亡通路。本實驗結果發現，單用姜黃素濃度在5 μmol/L以下時并未對BiP和CHOP蛋白表達有明顯的影響；而棕櫚酸能升高二者的表達，提示內質網應激發生；姜黃素干預能抑制棕櫚酸引起的BiP和CHOP表達升高，提示姜黃素對棕櫚酸引起的MSCs內質網應激有抑制作用。因此推測姜黃素對MSCs脂毒性損傷的改善可能是通過抑制內質網應激途徑實現的。

為了探究姜黃素對MSCs脂毒性損傷的改善是否有助于提高其干預效果，建立了體外HUVECs脂毒性損傷模型，并通過Traswell小室共培養系統將經過棕櫚酸或棕櫚酸+姜黃素預處理24 h后的MSCs與HUVECs進行共培養。結果發現，經過棕櫚酸+姜黃素預處理的MSCs相對于棕櫚酸單獨預處理的MSCs能更好地提高HUVECs細胞活性(分別為67%、89%)，提示姜黃素對MSCs脂毒性損傷的改善有助于提高其干預效果。Liu等[17]研究顯示姜黃素預處理脂肪來源的MSCs有助于提高其抗凋亡和促血管生成能力，從而提高MSCs的心肌修復能力。Wang等[18]發現姜黃素預處理MSCs可以提高其促小鼠皮膚傷口愈合能力，而此種促進作用與PGC-1α/SIRT3通路有關。因此推測姜黃素預處理MSCs可提高其對多種疾病模型的干預效果，其分子機制有待進一步研究。

綜上所述，姜黃素可以恢復棕櫚酸引起的MSCs細胞活性下降，減輕脂質沉積，緩解內質網應激，從而減輕MSCs脂毒性損傷；同時，此保護作用可提高MSCs對HUVECs脂毒性損傷的干預效果。