毛蘭素通過調控lncRNA LINC01354/miR-515-5p對前列腺癌細胞糖酵解、增殖、遷移和侵襲的影響

董建設， 趙俊峰， 張林超， 陳瑞廷， 于小明

(河南省中醫院泌尿外科，河南 鄭州 450000)

前列腺癌是生殖系統和泌尿系統最常見的惡性腫瘤之一，也是老年男性的主要健康問題[1-2]。由于早期篩查和癌癥治療方案的重要進展，過去40年間前列腺癌患者的總生存率和5年生存率有所提高[3]。但是，一旦疾病發展為去勢抵抗性前列腺癌，預后將急劇惡化[4-5]。因此，進一步闡明前列腺癌進展的分子機制對于尋找有效的治療方法具有重要意義。毛蘭素是從石斛中提取的聯芐類化合物，研究表明，毛蘭素可抑制肺癌A549細胞活力，誘導細胞凋亡[6]；還可有效抑制葡萄膜黑色素瘤細胞C918、MUM-2B的增殖，阻滯細胞周期，促進葡萄膜黑色素瘤細胞凋亡[7]；能夠抑制膀胱癌細胞的增殖，誘導細胞凋亡，阻滯細胞周期[8]。根據報道，長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，lncRNA)LINC01354在甲狀腺癌中異常表達[9]，可作為肺腺癌特異性診斷和預后的獨立生物標志物[10]。LINC01354在非小細胞肺癌組織和細胞中高表達，敲低其表達可抑制非小細胞肺癌細胞的增殖和侵襲[11]。資料顯示，miR-515-5p在前列腺癌組織和細胞中低表達，抑制前列腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲[12]。但毛蘭素和LINC01354對前列腺癌細胞糖酵解、增殖、遷移和侵襲的影響，以及LINC01354與miR-515-5p的靶向關系，且毛蘭素是否通過調控lncRNALINC01354/miR-515-5p影響前列腺癌細胞糖酵解、增殖、遷移和侵襲目前還尚未可知。因此，本研究以前列腺癌細胞DU145為對象，評價毛蘭素在細胞增殖、遷移、侵襲和糖酵解中的功能，旨在闡明其潛在機制。

1 材料與方法

1.1 細胞 人前列腺癌細胞株DU145購自中國科學院細胞研究所。

1.2 試劑與藥物 毛蘭素(純度≥99.7%，批號111874-201603)購自中國食品藥品檢定研究院。DMEM培養基購自美國Gibco公司；噻唑藍(MTT)、RIPA緩沖液購自美國Sigma-Aldrich公司；LINC01354過表達/小干擾RNA(pcDNA-LINC01354/si-LINC01354)、各自陰性對照(pcDNA/si-NC)、miR-515-5p模擬物、模擬物陰性對照miR-NC購自上海吉瑪制藥技術有限公司；葡萄糖測定試劑盒購自美國BioVision公司；乳酸測定試劑盒、雙辛可寧酸蛋白質測定試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；Transwell小室(8 μm孔徑)、基質膠購自美國BD Biosciences公司；增強的化學發光液購自美國EMD Millipore公司；TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司；PrimeScript RT-PCR、SYBR Green Master Mix購自日本TaKaRa公司；熒光素酶載體、熒光素酶報告基因測定系統購自美國Promega公司；細胞周期蛋白D1(cyclin D1)、p21、基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteases，MMP)-2、MMP-9、GAPDH一抗和辣根過氧化物酶結合的IgG二抗均購自艾博抗(上海)貿易有限公司。

1.3 細胞培養與分組 DU145細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養基，在37 ℃、5% CO2潮濕培養箱中培養。毛蘭素使用二甲基亞砜(DMSO，終濃度0.1%)助溶，并用DMEM培養基稀釋至相應劑量[6]。細胞分為對照組(0.1% DMSO)，毛蘭素低、中、高劑量組(20、40、80 nmol/L毛蘭素)，pcDNA組(轉染pcDNA)，pcDNA-LINC01354組(轉染pcDNA-LINC01354)，si-NC組(轉染si-NC)，si-LINC01354組(轉染si-LINC01354)，毛蘭素+pcDNA組(轉染pcDNA并給予80 nmol/L毛蘭素)，毛蘭素+pcDNA-LINC01354組(轉染pcDNA-LINC01354并給予80 nmol/L毛蘭素)，毛蘭素作用時間均為48 h。將DU145細胞以每孔2×105個的密度接種至6孔板，根據說明書操作步驟，通過Lipofectamine 2000與轉染復合物一起孵育24 h，進行轉染，再通過RT-qPCR檢測轉染效率，用于后續實驗。

1.4 葡萄糖消耗和乳酸水平檢測 DU145細胞在無葡萄糖的DMEM培養基中培養16 h，然后在常氧條件下與高葡萄糖DMEM培養基再孵育24 h，去除培養基，使用基于熒光的葡萄糖測定試劑盒檢測DU145細胞內葡萄糖水平，使用基于乳酸氧化酶的比色測定法在540 nm波長處讀取吸光度，并計算乳酸水平[13]。

1.5 MTT法檢測細胞增殖 DU145細胞以每孔5×103個的密度接種至96孔板，按“1.3”項下分組并孵育48 h，每孔加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL)，繼續孵育3～4 h，去除上清液，加入200 μL DMSO振蕩20 min，使用Epoch微孔板分光光度計在490 nm波長處檢測光密度(OD)值，并計算細胞增殖抑制率。

1.6 Transwell實驗檢測細胞遷移和侵襲能力 將無血清DMEM培養基稀釋的DU145細胞以每孔4×104個的密度接種至Transwell小室上室，并將含10%胎牛血清的DMEM培養基加入到下室，培養24 h，用棉簽除去膜上側的細胞，膜下側的細胞在室溫下用4%多聚甲醛固定30 min，并在室溫下用0.1%結晶紫染色30 min，侵襲實驗則需在Transwell小室的上室包被基質膠。使用光學顯微鏡獲取圖像，計數遷移、侵襲細胞數。

1.7 Western blot法檢測細胞中cyclin D1、p21、MMP-2、MMP-9蛋白表達 收集各組細胞，使用含蛋白酶和磷酸酶抑制劑的RIPA緩沖液，置于冰上裂解40 min，4 ℃、12 000 r/min離心20 min，使用雙辛可寧酸蛋白質測定試劑盒檢測蛋白濃度并定量。將蛋白與上樣緩沖液混合煮沸10 min進行變性，取40 μg蛋白樣品通過10% SDS-PAGE膠電泳分離，然后轉移到聚偏二氟乙烯膜上，室溫下封閉2 h，加入一抗cyclin D1、p21、MMP-2、MMP-9(1∶1 000)在4 ℃下孵育過夜，加入辣根過氧化物酶結合的IgG二抗(1∶5 000)37 ℃孵育2 h，采用增強的化學發光液曝光顯影，以GAPDH為內參，分析cyclin D1、p21、MMP-2、MMP-9蛋白表達。

1.8 RT-qPCR法檢測細胞LINC01354和miR-515-5pmRNA表達 收集各組細胞，使用TRIzol試劑從細胞中分離總RNA，逆轉錄為cDNA并定量2 μg。LINC01354正向引物序列5′-GCAATGGTTTGGGCAACTGTAT-3′，反向引物序列5′-GAAAAAGCAAGCTGCCATGAGA-3′；miR-515-5p正向引物序列5′-CGGGTTCTCCAAAAGAAAGCA-3′，反向引物序列5′-CAGCCACAAAAGAGCACAAT-3′；GAPDH正向引物序列5′-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3′，反向引物序列5′-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3′；U6正向引物序列5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反向引物序列5′-AACGCTTCA CGAATTTGCGT-3′。使用GAPDH和U6對lncRNA和miRNA的表達進行標準化，以2-ΔΔCT法計算目的基因相對表達。

1.9 熒光素酶報告基因檢測 應用在線軟件LncBase Predicted v.2鑒定出miR-515-5p作為LINC01354的潛在靶標。將含有miR-515-5p假定結合位點的LINC01354野生型3’非編碼區(3’UTR)及其突變體擴增并克隆到psiCHECK-2熒光素酶啟動子載體中，產生WT-LINC01354或MUT-LINC01354質粒。然后使用Lipofectamine 2000試劑將WT-LINC01354或MUT-LINC01354與miR-515-5p模擬物或miR-NC共轉染DU145細胞，48 h后收集細胞，并根據說明書使用熒光素酶報告基因測定系統評估熒光素酶活性。

2 結果

2.1 毛蘭素對DU145細胞糖酵解的影響 如表1所示，與對照組比較，毛蘭素各劑量組細胞葡萄糖消耗和乳酸水平均減少(P<0.05)，且呈劑量依賴性(P<0.05)。

表1 毛蘭素對DU145細胞糖酵解的影響

2.2 毛蘭素對DU145細胞增殖的影響 如圖1、表2所示，與對照組比較，毛蘭素各劑量組細胞增殖抑制率和p21蛋白表達升高(P<0.05)，cyclin D1蛋白表達降低(P<0.05)，且呈劑量依賴性(P<0.05)。

圖1 細胞增殖相關蛋白表達

表2 毛蘭素對DU145細胞增殖的影響

2.3 毛蘭素對DU145細胞遷移和侵襲的影響 如圖2、表3所示，與對照組比較，毛蘭素各劑量組遷移和侵襲細胞數減少(P<0.05)，MMP-2、MMP-9蛋白表達降低(P<0.05)，且呈劑量依賴性(P<0.05)。

注：A為遷移和侵襲相關蛋白表達，B為DU145細胞遷移和侵襲實驗(×200)。

表3 毛蘭素對DU145細胞遷移和侵襲的影響

2.4 毛蘭素對DU145細胞LINC01354、miR-515-5pmRNA表達的影響 如表4所示，與對照組比較，毛蘭素各劑量組細胞內LINC01354表達降低(P<0.05)，miR-515-5pmRNA表達升高(P<0.05)，且呈劑量依賴性(P<0.05)。

表4 毛蘭素對DU145細胞中LINC01354、miR-515-5p mRNA表達的影響

2.5LINC01354靶向調控miR-515-5p表達 如圖3、表5所示，LINC01354與miR-515-5p含有互補的核苷酸序列。與miR-NC組比較，miR-515-5p組抑制WT-LINC01354的熒光素酶活性(P<0.05)；miR-NC組與miR-515-5p組MUT-LINC01354的熒光素酶活性差異無統計學意義(P>0.05)。如表6所示，pcDNA-LINC01354組miR-515-5p表達低于pcDNA組(P<0.05)；si-LINC01354組miR-515-5p表達高于si-NC組(P<0.05)。

圖3 LINC01354序列中含有與miR-515-5p互補的核苷酸序列

表5 雙熒光素酶報告實驗

表6 LINC01354調控miR-515-5p表達

2.6 抑制LINC01354表達對DU145細胞糖酵解、增殖、遷移和侵襲的影響 如圖4、表7～8所示，與si-NC組比較，si-LINC01354組細胞LINC01354 mRNA表達和cyclin D1、MMP-2、MMP-9蛋白表達降低(P<0.05)，miR-515-5pmRNA表達和p21蛋白表達升高(P<0.05)，葡萄糖消耗和乳酸水平降低(P<0.05)，細胞增殖抑制率升高(P<0.05)，遷移和侵襲細胞數減少(P<0.05)。

注：A為細胞增殖、遷移侵襲相關蛋白表達，B為細胞遷移和侵襲實驗(×200)。

2.7LINC01354過表達逆轉了毛蘭素對DU145細胞糖酵解、增殖、遷移和侵襲的作用 如圖5、表9～10所示，與毛蘭素+pcDNA組比較，毛蘭素+pcDNA-LINC01354組細胞LINC01354 mRNA表達和cyclin D1、MMP-2、MMP-9蛋白表達升高(P<0.05)，miR-515-5pmRNA表達和p21蛋白表達降低(P<0.05)，葡萄糖消耗和乳酸水平升高(P<0.05)，細胞增殖抑制率降低(P<0.05)，遷移和侵襲細胞數增加(P<0.05)。

表7 抑制LINC01354表達對DU145細胞糖酵解、增殖、遷移和侵襲的影響

表8 抑制LINC01354表達對DU145細胞增殖、遷移和侵襲相關蛋白表達的影響

注：A為細胞增殖、遷移侵襲相關蛋白表達，B為細胞遷移和侵襲實驗(×200)。

3 討論

目前，毛蘭素的多種藥理作用已被闡明，包括抗氧化和抗腫瘤活性[14]。數項研究證明，毛蘭素在多種不同的人類癌細胞中均具有突出的抗癌活性，其中包括乳腺癌細胞系T47D，人類肝癌Bel7402和黑色素瘤A375細胞、人類早幼粒細胞白血病HL-60細胞、人骨肉瘤細胞[15]、宮頸癌HeLa細胞[16]和鼻咽癌細胞系(NPC-039和NPC-BM)[17]等。毛蘭素能通過誘導細胞死亡和抑制肺癌細胞中的細胞遷移而發揮抗肺癌活性[18]；毛蘭素還能降低肝癌細胞的生存能力，抑制其增殖和遷移，誘導G2/M期阻滯，增強癌細胞凋亡，促進細胞內活性氧水平的增加和線粒體膜電位的降低，并調節肝癌HepG2和SMMC-7721細胞中抗凋亡和促凋亡相關蛋白的表達[19]。然而毛蘭素在前列腺癌中的功能與機制仍有待探索。腫瘤細胞中的各種代謝途徑(包括糖酵解和核酸，蛋白質或脂質的生物合成)被改變，代表了抗癌治療的有希望的靶點[20]。本研究方向，各劑量毛蘭素均能降低DU145細胞的葡萄糖消耗、乳酸水平、遷移和侵襲細胞數，提高細胞增殖抑制率，并呈劑量依賴性，表明毛蘭素具有抑制前列腺癌細胞增殖、遷移、侵襲和糖酵解的作用。此外，各劑量毛蘭素均降低了cyclin D1、MMP-2、MMP-9蛋白表達，提高了p21蛋白表達，并呈劑量依賴性，進一步證明了毛蘭素抗前列腺癌細胞增殖和轉移的能力。

lncRNA是一組可以在染色質修飾，轉錄或轉錄后水平上調節基因表達的非蛋白質RNA[21]。迄今為止，已報道許多與前列腺癌相關的lncRNA的異常表達，并通過靶向相應的基因來影響前列腺癌細胞的增殖、轉移或凋亡[22]。

表9 LINC01354過表達逆轉了毛蘭素對DU145細胞糖酵解、增殖、遷移和侵襲的作用

表10 LINC01354過表達逆轉了毛蘭素對DU145細胞增殖、遷移和侵襲相關蛋白表達的作用

LINC01354是lncRNAs的成員，在骨肉瘤組織和細胞中過表達，上調其表達可促進骨肉瘤細胞的侵襲[23]；也在結直腸癌組織和細胞中表達上調，干擾其表達可抑制結直腸癌細胞的增殖和遷移[24]。盡管如此，LINC01354在前列腺癌中的具體作用尚未得到充分解釋。本研究首次發現，毛蘭素對前列腺癌細胞中LINC01354的表達具有抑制作用。在抑制LINC01354表達后，前列腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力，cyclin D1、MMP-2、MMP-9蛋白表達均降低，且葡萄糖消耗和乳酸水平減少，p21蛋白表達升高，表明LINC01354參與前列腺癌的發生發展，抑制其表達有助于抑制前列腺癌細胞的增殖、遷移、侵襲和糖酵解。此外，LINC01354過表達后，毛蘭素抑制前列腺癌細胞葡萄糖消耗和乳酸水平，增殖、遷移和侵襲，cyclin D1、MMP-2、MMP-9蛋白表達的作用均被逆轉，其促進p21蛋白表達的作用也被逆轉。表明毛蘭素可能通過下調前列腺癌細胞中LINC01354的表達，發揮腫瘤抑制功能。

miRNA是長度在20至22個核苷酸之間的非編碼RNA分子，在進化中高度保守，主要通過調控下游基因來調節重要的細胞過程[25]。lncRNA被證明通過結合miRNA來調節腫瘤的進程[26]，如LINC00673可以通過充當miR-515-5p的海綿來促進乳腺癌進展[27]。研究發現，miR-515-5p在乳腺癌組織和細胞中下調表達，參與乳腺癌細胞增殖、遷移和侵襲調控[28]。本研究發現，毛蘭素以劑量依賴性地促進前列腺癌細胞中miR-515-5p的表達。此外，上調細胞中LINC01354表達時，miR-515-5p表達被抑制；下調LINC01354表達時，miR-515-5p表達被促進。研究還發現，LINC01354過表達逆轉了毛蘭素促進miR-515-5p表達的作用，表明毛蘭素通過LINC01354/miR-515-5p發揮抗前列腺癌作用。

綜上所述，毛蘭素能夠通過調節LINC01354/miR-515-5p表達抑制前列腺癌細胞的增殖、遷移、侵襲和糖酵解。因此，毛蘭素是一種很有前途的抗癌化合物。