金銀花色澤與酚酸類成分含量相關性研究

熊樂文， 金 瑩， 黃瑋慕， 王彥予， 黃文靜， 張永清， 趙宏偉， 張龍霏

(山東中醫藥大學，山東 濟南 250355)

金銀花具有清熱解毒、疏散風熱等功效，對治療外感風熱、溫病發熱等感染性疾病療效顯著[1-3]。由于金銀花藥材市場需求量大，目前主要依靠人工栽培滿足需要，全國大部分省市均有種植。不同產區由于生態環境、采收時間與干燥方法等差異，致使金銀花藥材外觀及活性成分含量明顯不同[4-5]。如何科學合理地評價金銀花藥材質量，是業內近年研究的熱點和難點[6-8]。早期人們利用眼看、手摸、鼻聞、口嘗等傳統方法，通過觀察外形、色澤、大小、斷面等來評判藥材質量，并依此“辯狀論質”“分級歸檔”[9-10]。《中國藥典》從2000年版開始對金銀花成分含量進行限定，要求綠原酸含量不得少于1.5%[11]；2005年版增加木犀草苷，要求其含量不得少于0.10%[12]，2010年版修改為不得少于0.050%[13]；2020年版增加綠原酸、異綠原酸A和異綠原酸C，要求不得少于3.8%[1]。

藥材外觀性狀是其內部物質組成的外在反映，活性成分是藥材物質組成的一部分，藥材外觀性狀與活性成分之間可能存在一定的相關性。熊吟等[14]發現金銀花的顏色主要與含有的總黃酮含量有關，王玲娜[15]、馬云等[16]研究證明金銀花的顏色與活性成分含量密切相關，周潔等[17]研究結果顯示金銀花的褐變程度與綠原酸、木犀草苷含量呈顯著負相關，均證明金銀花藥材顏色與活性成分含量之間具有密切的相關性。本研究中收集金銀花藥材樣品60份，利用色差儀測定其顏色指標，對綠原酸、異綠原酸A和異綠原酸C進行含量測定，分析探討金銀花藥材色澤與其酚酸類質控成分含量之間的相關性，為明確依據外觀性狀評判藥材質量的科學性及根據藥材色澤預測金銀花酚酸類成分含量提供參考。

1 材料

CM-600d1型色差儀(杭州柯盛行儀器有限公司)；1260高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；KQ-500DE型超聲儀(河南兄弟儀器設備有限公司)；ME204/02型電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)；四號藥典篩(紹興市上虞張興紗篩廠)。

綠原酸(批號Y22M8K36544，純度≥98%)、異綠原酸A(批號Z05M10X87215，純度≥98%)、異綠原酸C(批號Y03S10H95976，純度≥98%)對照品(上海源葉生物科技有限公司)。乙腈、甲醇、磷酸(色譜純，天津市科密歐化學試劑有限公司)。

金銀花藥材由山東中平藥業有限公司收集，共60批，編號為1～60，取自全國不同產區，經山東中醫藥大學張永清教授鑒定，均為忍冬科植物忍冬LonicerajaponicaThunb.的干燥花蕾或帶初開的花。

2 方法

2.1 顏色測定

2.1.1 掃描條件 將金銀花藥材粉碎后過四號藥典篩，四分法取樣，備用。測量條件光源為D65，觀察角度為10°，照明口徑Ф50 mm，波長掃描范圍為780～380 nm，掃描速度為600 nm/min。將金銀花藥材粉末均勻平鋪于色差儀粉末測試盒內，平行測定10次，取平均值。

2.1.2 精密度試驗 取同一供試品粉末，連續測量10次，分別得出表征顏色的L*、a*、b*值，RSD分別為1.54%、1.72%、1.12%，表明色差儀精密度良好。

2.1.3 重復性試驗 取同一供試品粉末5份，每份樣品平行測定10次取平均值，L*、a*、b*值的RSD分別為1.77%、1.92%、1.38%，表明重復性良好。

2.2 綠原酸和總酚酸含量測定

2.2.1 色譜條件 Syncronis C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相0.1%磷酸(A)-乙腈(B)，梯度洗脫(0～8 min，14%～19%B；8～14 min，19%B；14～34 min，19%～31%B；34～35 min，31%～90%B)；檢測波長327 nm；體積流量0.7 mL/min；進樣量2 μL；柱溫24 ℃。

2.2.2 對照品溶液制備 精密稱取綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C對照品適量，用75%甲醇溶解得質量濃度分別為0.40、0.20、0.04 mg/mL混合對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液制備 取藥材粉末約0.5 g，精密稱定，置50 mL具塞錐形瓶中，精密加75%甲醇50 mL，密塞，稱定質量，超聲處理30 min，75%甲醇補足減失的質量，搖勻，0.22 μm濾膜過濾，取續濾液，即得。

2.2.4 線性關系考察 取混合對照品溶液，稀釋后得混合對照品溶液，在“2.2.1”項色譜條件下分別進樣，測定綠原酸、異綠原酸A及異綠原酸C峰面積，以質量濃度(X)為橫坐標，峰面積(Y)為縱坐標，得回歸方程Y綠原酸=8 830.4X-69.439(r=0.999 6)，Y異綠原酸A=10 580X-42.884(r=0.999 6)，Y異綠原酸C=10 580X-42.884(r=0.999 5)，表明綠原酸在80.0～400.0 μg/mL、異綠原酸A在40.0～200.0 μg/mL、異綠原酸C在8.0～40.0 μg/mL范圍內線性關系良好。

2.2.5 精密度試驗 將混合對照品溶液在“2.2.1”項色譜條件下重復進樣6次，測定綠原酸、異綠原酸A及異綠原酸C峰面積，RSD分別為0.47%、0.27%、0.39%，表明儀器精密度良好。

2.2.6 重復性試驗 取同一批金銀花藥材粉末制備供試品溶液，共6份，在“2.2.1”項色譜條件下測定綠原酸、異綠原酸A和異綠原酸C峰面積，RSD分別為0.96%、0.87%、0.90%，表明該方法重復性良好。

2.2.7 穩定性試驗 取同一供試品溶液，分別在0、4、8、12、24 h進樣，在“2.2.1”項色譜條件下進樣測定，3種成分峰面積的RSD分別為0.34%、0.65%、0.74%，說明溶液在24 h內穩定性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗 取5份供試品粉末，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，分別加入對照品溶液，在“2.2.1”項色譜條件下進樣測定，計算得綠原酸、異綠原酸A和異綠原酸C平均加樣回收率分別為96.64%、97.35%、97.66%，RSD分別為1.65%、1.79%、1.69%。

2.3 相關性分析 將金銀花藥材顏色指標值L*、a*、b*分別與酚酸類質控成分綠原酸、總酚酸類含量相關聯，用SPSS 22.0軟件進行相關性分析。

3 結果

3.1 含量測定結果 分別制備60批金銀花藥材的供試品溶液，每批樣品平行3次，測定峰面積平均值，根據標準曲線計算綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C百分含量。總酚酸含量以綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C三者百分含量的總量計。結果見表1。

表1 各成分含量測定結果

表1中金銀花藥材顏色指標是用CIE色度空間系統法L*、a*、b*表示的。L*代表亮度，L*值越大則表示亮度越高；a*代表紅-綠色值，a*越大表示顏色越紅，a*越小表示顏色越綠；b*代表黃-藍色值，b*越大表示顏色越黃，b*越小表示顏色越藍[18]。結果顯示，60份金銀花藥材樣品的顏色指標變化范圍分別為L*33.58～48.77、a*6.96～15.96、b*36.12～57.17；綠原酸含量變化范圍為0.58%～4.31%，總酚酸含量變化范圍為0.88%～6.12%。

3.2 顏色指標與成分含量的相關性 金銀花藥材外觀顏色越綠，酚酸類成分含量越高。顏色越紅或越黃，酚酸類成分含量越低，見表2。

表2 金銀花藥材顏色指標與綠原酸、總酚酸含量的相關性

表2結果顯示，綠原酸與L*、a*、b*的相關系數分別為0.842、-0.863和-0.907，雙尾檢驗概率P均小于0.01，說明綠原酸含量與L*、a*、b*在0.01水平上有顯著相關性，且綠原酸與L*呈正相關，與a*和b*呈負相關；總酚酸與L*、a*、b*相關系數分別為0.796、-0.849和-0.879，雙尾檢驗概率P均小于0.01，說明總酚酸含量與L*、a*和b*在0.01水平上有相關性，且總酚酸亦與L*呈正相關，與a*和b*呈負相關。

3.3 可行性分析 以綠原酸和總酚酸含量為因變量，顏色指標L*、a*和b*為自變量，將表1數據進行多元線性回歸，得回歸方程Y綠原酸=4.108+0.057L*-0.105a*-0.065b*，R2=0.864；Y總酚酸=8.047+0.056L*-0.174a*-0.106b*，R2=0.811。

另取20批金銀花藥材，編號S1～S20，測定其顏色指標L*、a*和b*，分別代入回歸方程計算綠原酸及總酚酸預測含量，并與實測含量進行比較，結果見表3。

表3結果顯示，在金銀花中綠原酸平均實測含量低于平均預測含量3.79%，而總酚酸的平均實測含量高于平均預測含量7.64%。依據顏色指標數據預測，金銀花綠原酸含量全部符合要求，但有6個樣品總酚酸含量不能達標。實測結果顯示有1個樣品綠原酸含量沒有達標，3個樣品總酚酸含量不符合要求。實測與預測誤差超10%的樣品，綠原酸有5個，占25%，總酚酸有4個，占20%。有些樣品預測含量與實測含量相差較大，這與方程建立依據的樣品數量偏少有關。

4 討論

金銀花的主要功效為清熱解毒，酚酸類物質是其藥效成分之一[19]。金銀花藥材顏色指標與其酚酸類質控成分含量之間具有極顯著相關性，可以根據顏色指標來預測酚酸類質控成分含量，簡化操作程序，提高檢測效率。

表3 金銀花藥材預測與實測綠原酸、總酚酸含量(%)

金銀花藥材綠原酸和總酚酸含量均與L*呈正相關、與a*、b*呈負相關。依據測定結果，分析得到回歸方程，測得顏色指標L*、a*和b*預測綠原酸、總酚酸含量。為驗證預測的準確性，收集金銀花藥材樣品20份，分別對其綠原酸與總酚酸含量進行預測和實測，結果綠原酸平均實測含量低于平均預測含量3.79%，總酚酸平均實測含量高于平均預測含量7.64%。

總酚酸含量超過3.8%，綠原酸含量會超過1.5%，若總酚酸含量達標綠原酸含量必然達標，通過預測總酚酸含量可達到判斷金銀花藥材是否符合要求。目前計算預測含量的回歸方程來自60份金銀花藥材樣品，增加樣品數量，回歸方程準確度會進一步提高。本研究為建立有效、簡便、客觀的金銀花質量評價體系奠定基礎。