水稻細條病的發(fā)生發(fā)展及抗病基因研究進展

劉 維，劉芳丹，陸展華，盧東柏，王石光，王曉飛，薛 皦，何秀英,

（1廣東省農(nóng)業(yè)科學院水稻研究所/廣東省水稻育種新技術(shù)重點實驗室，廣州 510640；2華南農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，廣州 510642）

0 引言

水稻細菌性條斑病(Bacterial leaf streak)簡稱細條病或BLS，是由稻黃單胞菌水稻致病變種（Xɑnthomonɑs oryzɑepv.oryzicolɑ，縮寫Xoc）引起的，分布于亞熱帶地區(qū)的檢驗檢疫性細菌病害，具有流行性、毀滅性和爆發(fā)性等發(fā)生特點。此病最早于1918年在菲律賓地區(qū)被發(fā)現(xiàn)[1]，隨后廣泛傳播于亞洲的熱帶地區(qū)和亞熱帶地區(qū)。1955 年中國廣東省首次發(fā)現(xiàn)該病害，一般情況下會導(dǎo)致水稻減產(chǎn)15%～25%，嚴重時減產(chǎn)40%～60%，甚至顆粒無收[2]。近幾年中國超過11個省份發(fā)現(xiàn)有水稻細條病，主要包括華南和長江中下游稻作區(qū)，該病害嚴重影響水稻籽粒的灌漿充實，造成稻谷大量減產(chǎn)，目前已成為華南和中南稻區(qū)的主要細菌性病害[3]。科學家從病害的發(fā)生展開研究，提出加強檢驗檢疫和合適的耕作方式是防治該病害的有效途徑，化學試劑對該病害有一定的防治作用，而開展抗細條病水稻材料的鑒定與抗病基因發(fā)掘利用是控制該病害最為經(jīng)濟、有效的手段。

1 細菌性條斑病的危害與防治

1.1 細條病危害癥狀

細菌性條斑病主要危害于水稻的葉片，Xoc最初是通過氣孔進入水稻的葉肉組織，隨后將會侵染和危害薄壁細胞，幼齡葉片是最容易受害的。病斑最初為暗綠色的水浸狀半透明小點，局限在葉脈間的薄壁細胞，隨后很快在葉脈間向下擴展，最終擴展為暗綠至黃褐色的細條斑。病斑上時常會溢出大量串珠狀的黃色菌膿，干燥后則呈膠狀小粒依附在葉片表面上，不易脫落。危害嚴重時許多病斑連在一起形成大塊枯死斑，隨后病斑不斷延伸擴展，整片葉變成紅褐色、黃褐色，最后形成枯白斑。該病病狀與水稻白葉枯病的病狀相似，但不同的是，當用葉片對著光時可看見許多半透明的條斑。

1.2 細條病的發(fā)生情況

種子帶菌是導(dǎo)致細條病發(fā)生的重要原因之一，同時是遠距離傳播該病的重要途徑。在發(fā)病區(qū)，病原菌以水稻種子、稻草、稻樁及部分禾本科雜草為寄主越冬或越季，成為初侵染源，可存活超過1年[4]，在下一季水稻播種后，病原菌從秧苗鞘或葉鞘的氣孔侵入并不斷繁殖，完成初侵染。在插秧時通過病秧帶入本田，通過流水、風雨、葉片接觸等完成二次侵染。

不同水稻品種的抗病性會有所不同。一般來說常規(guī)稻抗性強于雜交稻，窄葉品種抗性強于闊葉品種，糯稻的抗性最強，其次是粳稻抗性，秈稻抗性最差[5]。抗白葉枯病的水稻品種不一定抗水稻細條病，矮桿品種抗性比高稈品種抗性強[6]。同一水稻品種最為抗病的生育時期是苗期至分蘗期，到分蘗末期時抗病力會下降，而孕穗期是最易感病的時期。

從分蘗盛期到始穗期是水稻植株抗細菌性病害能力最弱的階段，而高溫高濕的天氣是致使水稻細條病發(fā)生發(fā)展的最重要的環(huán)境條件。當氣溫在26～30℃、相對濕度在85%以上時，容易導(dǎo)致此病發(fā)生[7-8]。其中引起水稻細條病大面積發(fā)生的最主要原因是臺風和暴雨。

水稻細條病發(fā)生嚴重往往是由于田間管理不當而造成的，如遲施和偏施氮肥，漫灌串灌、低洼積水等因素。施基肥不足，追肥遲施多施、氮肥過施時很容易造成水稻植株徒長，抗病力下降，從而導(dǎo)致水稻植株嚴重發(fā)病。當植株生長旺盛時，就會導(dǎo)致無效分蘗數(shù)增多，植株間的空隙變小，摩擦增多，空氣流通性變差，水稻抗病能力變?nèi)酰罱K導(dǎo)致傳染率增加[9-11]。

在已經(jīng)感染病毒的田塊作業(yè)時，如果在早晨露水未干或下雨后就進行噴藥、除草等工作，病原菌很容易附著到衣服和器具上，會導(dǎo)致病原菌在水稻田間加速擴散，最終導(dǎo)致大規(guī)模水稻病害的發(fā)生。

1.3 防治措施

目前，育種家還沒有培育出高抗細菌性條斑病的水稻品種，只有極少數(shù)材料具有一定的抗病性，控制水稻細菌性條斑病還主要依賴于化學藥品的防治，以噻唑類化學藥劑為主交替輪換使用避免病原菌產(chǎn)生耐藥性[12]。但是在復(fù)雜的田間環(huán)境中單靠化學防治是遠遠不夠的，需結(jié)合多種防治方法綜合治理，這樣才能更好地對水稻細條病的發(fā)生進行防治防控。

首先要加強植物檢疫，避免從病區(qū)調(diào)種，并嚴格控制病種外調(diào)[13]。其次要加強疫情監(jiān)控調(diào)查，在發(fā)病區(qū)域周圍設(shè)立監(jiān)測點，密切監(jiān)測，及時掌握病情發(fā)生動態(tài)并準確采取應(yīng)對措施[14]。然后是合理布局抗耐病品種，根據(jù)每個品種生育期、株高、葉片寬窄等特點，在合理的田塊布置適宜的品種，避免細條病大面積爆發(fā)[15]。最后是要加強田間管理，做到合理施肥和科學控水[16]。保證基肥充足，追肥及時，增施磷肥和鉀肥，避免氮肥的偏施和遲施。前期需保證淺水灌溉，薄水養(yǎng)蘗，配備溝渠，避免串灌和漫灌。中期以水制肥，適時曬田控氮，抑制無效分蘗。后期需改善水稻栽培環(huán)境，在收獲后期要及時清除秸稈及田塊中的病殘體，避免稻草稻樁成為病原體的越冬場所，減少發(fā)病風險與控制成本。

2 細菌性條斑病病原菌檢測

2.1 傳統(tǒng)檢測方式

2.1.1 產(chǎn)地檢疫 在國內(nèi)引種和調(diào)種前，到產(chǎn)地進行實地考察及全面檢測，特別是在孕穗期和抽穗期，需要對繁種田塊進行產(chǎn)地檢驗。這種方式十分有效，但耗時耗力，已經(jīng)被當下新興的檢驗檢疫方式所淘汰。

2.1.2 育苗生長觀測法 將種子播種在溫室或田間觀測幼苗的生長狀況，記錄其是否有在葉脈間出現(xiàn)暗綠色水浸狀透明小點，是否最終形成暗綠色至黃褐色細條狀病斑。這是一種傳統(tǒng)而經(jīng)典的檢測方法，但是由于受季節(jié)與外界環(huán)境的影響，需要嚴格控制種植條件，同樣費時費力，很難應(yīng)用于大批量的檢測工作中。

2.1.3 顯微鏡觀察 在水稻細菌性病害發(fā)生的初期，還沒有出現(xiàn)典型性癥狀時，由于發(fā)病部位的維管束組織和薄壁細胞上會存在大量的細菌，所以可以在低倍顯微鏡下進行檢查，將切取的小塊發(fā)病組織置于載玻片上，如果出現(xiàn)噴菌現(xiàn)象，則可判定是細菌性病害。

2.1.4 直接分離法 在固體培養(yǎng)基上分離并培養(yǎng)待測材料中的病原菌，可以有效防止其他非病原菌對檢疫菌的干擾。在適當條件下培養(yǎng)一定時間后，可在培養(yǎng)基表面獲得所需要的特征性菌落。

2.2 血清學檢測技術(shù)

血清學技術(shù)于1918 年首次應(yīng)用于植物病原菌的檢測研究，隨著該技術(shù)的廣泛應(yīng)用，目前它已成為了鑒定、檢測和分類植物病原體的最有用工具之一。最常用的血清學方法有：奧氏雙擴散法(ODD)、試管凝集法、免疫熒光法(IFT)、酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、和免疫分離法等[17]。血清學檢測技術(shù)對水稻細條病菌檢測的應(yīng)用也較為廣泛。方中達等[18]通過對比白葉枯病菌、李氏禾條斑病菌和水稻細條病菌在血清學上的差異，證明了水稻細條病菌具有獨特的血清學特異性。王公金等[19]和謝關(guān)林等[20]利用免疫放射檢測法對水稻細菌性條斑病菌進行了快速檢測，該方法制備出來的抗體雖然會與白葉枯病菌有交叉反應(yīng)，但不會與其他病原菌發(fā)生交叉反應(yīng)，因此可以利用此種方法對種子帶菌部位和帶菌率進行相應(yīng)的檢測。

除此之外，酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)和免疫熒光法(IFT)目前也已經(jīng)廣泛應(yīng)用于檢測水稻細條病菌和水稻白葉枯病菌。由于血清學檢測技術(shù)更加的靈敏快速，且具有高特異性，所以該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于細菌性病原的檢驗檢疫中。但在實際檢驗檢疫過程中，抗血清質(zhì)量通常與非同源的抗源發(fā)生交叉反應(yīng)，并且有時候太過專化，因此這就制約了血清學檢測技術(shù)在種子病原菌檢疫中的開展和應(yīng)用。

2.3 分子檢測技術(shù)

聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)是一種體外核酸擴增技術(shù)，發(fā)展于20 世紀80 年代。這種以PCR 為基礎(chǔ)的分子檢測技術(shù)具有高效靈敏、穩(wěn)定可靠、重復(fù)性、產(chǎn)率高等特點。隨著近些年來生物信息學和測序技術(shù)的飛速發(fā)展和創(chuàng)新，目前在水稻細條病菌的檢測和鑒定工作中已經(jīng)有了許多不同的PCR 檢測技術(shù)。其中廣泛應(yīng)用分子檢測技術(shù)有rep-PCR(repetitive DNA-PCR)、ITS-PCR(intergenic transcribed space-PCR)、ARDRA(amplified ribosomal DNA restric-tion analysis-PCR)、和實時熒光定量PCR(real-time quantitative PCR)技術(shù)[21]。

Louws等[22]分析了黃單胞菌屬內(nèi)的不同種和致病變種，研究表明rep-PCR 指紋圖譜技術(shù)可以區(qū)分出同種內(nèi)的不同致病變種，如水稻細條病菌和水稻白葉枯病菌等。王春連等[23]結(jié)合傳統(tǒng)病理學并且利用REPPCR 法和IS-PCR 法對中國長江以南的128 個水稻白葉枯病菌群體進行了遺傳多樣性分析，在中國的5 個鑒別品種中對128 個病原菌進行測定和病原型分群。姬廣海等[24]采用Rep-PCR 技術(shù)對30 個水稻細條病菌株進行了遺傳多樣性分析，并且同時比較了李氏禾條斑病菌等其他10個參試菌株，實驗表明了在Rep-PCR指紋圖譜中，自然界中的無毒性菌株、弱菌株和毒性菌株存在很大的差異，毒性菌株的遺傳分簇與其致病性具有一定的關(guān)聯(lián)性。因此，此種方法可有效地檢測出水稻細條病菌的遺傳變異，用于菌株的鑒定和分類學研究。廖曉蘭等[25]根據(jù)含鐵細胞接受子基因設(shè)計了細條病菌與白葉枯病菌的特異性探針（Baiprobe 和Tiaoprobe）和通用引物PSRGF PSRGR，采用實時熒光PCR方法對1種植原體和13種細菌進行了檢測，并成功建立了快速檢測鑒定水稻細條病菌和水稻白葉枯病菌的實時熒光PCR 方法。研究表明目標病原菌能分別被2 個特異性探針進行特異性檢測，并產(chǎn)生熒光信號，而其他參考菌則不能。實時熒光PCR法作為一種基因鑒定診斷方法，具有簡單靈敏、穩(wěn)定可靠的特點，但是由于此種方法的技術(shù)條件要求較高，儀器設(shè)備和材料費用也比較昂貴，所以在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和植物檢疫等方面的實際推廣應(yīng)用中還存在難度。

3 水稻抗細條病材料的發(fā)掘與鑒定

品種的抗病性是寄主與病原微生物協(xié)同進化的結(jié)果，抗病品種的培育和推廣種植是防治植物病害最為經(jīng)濟環(huán)保且有效的手段。當前在試驗和生產(chǎn)上能夠利用的抗細條病材料和基因非常有限，其中抗細條病稻種資源的鑒定篩選是挖掘抗細條病新基因的基礎(chǔ)和核心，也是當前抗細條病育種工作中首要亟待解決的問題。

夏怡厚等[26]在水稻苗期利用噴霧接種法對969份水稻品種進行抗細條病的人工接種鑒定，其中抗性品種占總數(shù)的14.55%，中抗品種占總數(shù)的55.83%，其中‘ACC8518’和‘ACC8558’是對水稻細條病具有廣譜性的高抗品種，可利用其作為抗病育種的親本。王漢榮等[27]在苗期和成株期對3343 份水稻品種進行抗細條病的人工接種鑒定。研究發(fā)現(xiàn)抗性品種占鑒定總數(shù)的5.77%，而中抗品種占鑒定總數(shù)的15.55%，其余品種為中感以下。岑貞陸等[28]在分蘗期利用改良針刺法對來自廣西區(qū)試、國際稻圃和南寧野生稻圃的1251份稻種材料進行抗細條病的人工接種鑒定，抗性品種占0.9%，中抗品種占4.2%，其余品種為中感。肖友倫等[29]采用針刺接種法對湖南省54 個水稻主栽品種進行抗性鑒定，發(fā)現(xiàn)中抗以上的品種占14.81%。涂軍等[30]用強致病力菌株RS105對‘鎮(zhèn)稻88’、‘武育粳3號’等60 個水稻品種進行水稻細條病的抗性評價。研究結(jié)果表明，60個水稻品種中有8個高抗品種，占總數(shù)的13.3%；中抗品種有35個，占總數(shù)58.3%。馮愛卿等[31]利用苗期噴霧法對318 份國外稻種資源、59 個中國水稻品種以及13 個抗白葉枯病近等基因系進行了水稻細條病的抗性評價，最終篩選出了49 個抗性稻種資源。楊俊等[32]選用Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅵ型代表菌株對云南省的80個主栽和區(qū)試水稻品種進行抗性評價，篩選出9 個對3 種致病型都表現(xiàn)為抗性的品種，其中‘Deyou16’和‘Changgui2’表現(xiàn)為高抗。

4 抗細條病基因的定位與克隆

用優(yōu)良抗性材料培育抗水稻細條病的品種是最為經(jīng)濟有效和對環(huán)境友好的防治辦法，而鑒定發(fā)掘優(yōu)異抗性資源和基因是抗性品種培育的關(guān)鍵因素[33]。曾經(jīng)有不少的學者認為水稻對細條病的抗性屬于數(shù)量性狀抗性，而不是質(zhì)量性狀抗性。但隨著科學技術(shù)的發(fā)展和對水稻細條病的深入研究，現(xiàn)在不斷有新的細條病主效抗病基因或QTL被鑒定和發(fā)現(xiàn)，結(jié)合Khush[34]、吳為人等[35]、鄭景生等[36]、何月秋等[37]、張紅生等[38]、周明華等[39]、徐建龍等[40]、黃大輝等[41]、賀文愛等[42]、鄒麗芳等[43]的研究結(jié)果逐步證實了不同抗源材料擁有不同的抗病遺傳機制，稻種資源抗細條病的抗病遺傳機制是多樣性的。

因為每個QTL 的效應(yīng)值較小且容易受到環(huán)境條件的影響，所以導(dǎo)致了細條病抗性QTL定位和克隆都比較困難，國內(nèi)外關(guān)于水稻細條病的抗性QTL的克隆研究不多，且絕大多數(shù)尚處于初步定位階段。目前共有19 個水稻細條病抗性QTLs 被檢測到，分布于2、3、5、11 號等8 條染色體上，其中位于第5 號染色體短臂上的qBlsr5ɑ對抗病遺傳表型變異貢獻率最大。鄭景生等[36]利用中抗和高抗細條病的2 個秈稻品種‘明恢86’和‘佳輻占’構(gòu)建F2遺傳作圖群體，應(yīng)用SSR 標記在水稻第2 號染色體標記RM279-RM154 之間檢測到1個貢獻率達13.7%的抗細條病QTL。CHEN[44]等分別利用兩個群體‘Dular/Balilla’(DB)和‘Dular/IR24’(DI)，從高抗品種‘Dular’中鑒定出一個新的主效抗性QTL，命名為qBLSR-11-1，位于11 號染色體上的簡單序列重復(fù)(SSR)標記RM120 和RM441 之間。Xie 等[45]將QTLqBlsr5ɑ精細定位于30 kb的范圍內(nèi)，并通過定量RT-PCR、測序分析和RNA 干擾技術(shù)確定LOC_Os05g01710為QTLqBlsr5ɑ的候選基因。此外，Yuan等[46]的研究結(jié)果也證實了LOC_Os05g01710不僅是細條病抗性基因，同時也是水稻白葉枯病的抗性基因xɑ5。

由主效基因控制的質(zhì)量抗性性狀效應(yīng)大，遺傳基礎(chǔ)相對簡單，一旦被鑒定，更容易在基因克隆和功能研究上取得突破。目前對水稻細條病抗性主效基因的研究僅限于遺傳分析階段，定位的報道還比較少。Triplett 等[47]利用‘傳家寶’(Heirloom rice)水稻品種‘Carolina Gold Select’構(gòu)建遺傳群體，在4號染色體長臂1.09 Mb 的區(qū)段內(nèi)檢測到1 個顯性主效抗性基因Xo1，該基因?qū)喼藜殫l病生理小種表現(xiàn)出抗病，但是對非洲細條病生理小種卻表現(xiàn)出完全抗性。黃大輝等[48]將供體抗細條病普通野生稻‘DP3’和受體感細條病秈稻品種‘9311’通過雜交、回交和多代自交構(gòu)建近等基因系。最終將普通野生稻‘DP3’的抗性基因bls1定位在RM19400 和RM510 之間21 kb 的物理范圍內(nèi)。施力軍等[49]選擇均勻分布于水稻12 條染色體上的680 對SSR 引物對抗病親本‘DY19’和感病親本‘9311’進行DNA多態(tài)性檢測，篩選到在兩親本間具有多態(tài)性的SSR 引物261對，再利用這些多態(tài)性引物將抗細條病新基因bls2初步定位于染色體2 標記SL03與SL04 之間約4cM 的范圍內(nèi)。覃麗萍等[50]以高抗細條病的國際稻品種‘BJ1’與高感細條病品種‘油占8號’為親本，構(gòu)建251 個F2代單株定位分離群體，通過染色體步移法和SSR 分子標記篩選法將隱性主效抗細條病基因定位于第10 號染色體上約48.8cM處，該抗病基因與SSR標記RM258緊密連鎖，是一個新的抗水稻細菌性條斑病基因位點。

5 展望

5.1 水稻細條病發(fā)病形勢嚴峻

廣西欽州市2009—2013 年水稻細條病的發(fā)生程度在1～2 級以下，2014—2018 年發(fā)生程度提升為2 級以上，其中2014 和2018 年發(fā)生程度高達3～4級，造成水稻大面積減產(chǎn)，嚴重威脅水稻安全生產(chǎn)[51]。安徽省六安市在2005年首次發(fā)現(xiàn)該病，至2008年該病危害面積發(fā)展至最大146740 hm2，重病田塊水稻減產(chǎn)50%左右，少數(shù)田塊甚至絕收。在六安市各級植保部門的共同努力下，經(jīng)采取多種防治措施，近幾年危害面積逐漸減少，但新的疫情點仍在增加[52]。水稻細條病在湖南省茶陵縣也時常發(fā)生，1980—1988 年時病情指數(shù)為15～45，1991—2002 年時病情指數(shù)為下降為8～43，而2012—2018 年期間病情指數(shù)又上升為5.6～28，其中2017 年發(fā)生面積高達1000 hm2，2018 年發(fā)生面積為200 hm2[53]。海南省已成為是中國最重要的水稻種子生產(chǎn)基地，三亞、樂東、陵水等地成為水稻細條病菌發(fā)生的重災(zāi)區(qū)，病情指數(shù)和發(fā)病率都比較高，損失較為嚴重，然而關(guān)于海南水稻細條病菌株的研究至今未見報道，從海南運回來的稻種未經(jīng)嚴格檢驗檢疫，這些將嚴重影響海南乃至全中國水稻細條病的安全防控[54-55]。

5.2 水稻細條病的長期防控防治

強化細條病檢測與防控，首先要嚴格按照《水稻種子產(chǎn)地檢疫規(guī)程》，加強對水稻種植基地和流通的種子檢疫監(jiān)管，禁止疫情發(fā)生區(qū)種子的流通；其次要根據(jù)《水稻細菌性條斑病監(jiān)測規(guī)范》要求，切實加強監(jiān)督調(diào)查，密切關(guān)注發(fā)生發(fā)展動態(tài)，做到底數(shù)清、情況明，為科學防控提供有力的決策依據(jù)；第三，做好種子檢測和殺菌消毒，盡量不要種帶菌種子，抓住水稻易感孕穗期，周期性進行藥劑防治，提高科學防控效果；第四，加強防控指導(dǎo)，開展防控技術(shù)培訓(xùn)，特別是病害發(fā)生關(guān)鍵時期，發(fā)放防治藥物，深入田間地頭，手把手指導(dǎo)農(nóng)民科學防控，提高防治效果。

5.3 抗病品種的培育是防治病害的有效手段

中國擁有豐富的稻種資源，普通野生稻作為亞洲栽培稻的祖先，蘊含著豐富的抗病基因源，然而，在生產(chǎn)上還未見抗細條病品種大面積推廣應(yīng)用。抗病材料的鑒定是抗病基因發(fā)掘的基礎(chǔ)，抗病基因發(fā)掘是抗病品種培育的核心。生產(chǎn)上能夠利用的抗細條病材料和基因非常有限，一方面要細化細條病鑒定方法，加強抗病材料的篩選；另一方面，前人鑒定到的抗細條病材料，如‘ACC8518’、‘ACC8558’、‘Deyou16’和‘Changgui2’等，在沒有克隆的相應(yīng)抗病基因之前，也可以利用傳統(tǒng)雜交育種和系譜選育的方法進行抗細條病品種的培育；另外，抗細條病基因的克隆和分子機理解析將為抗病品種的培育提供最佳的基因資源。