田薊苷-磷脂酰膽堿復合物的制備及其體內藥動學研究

尚曙玉， 張鐵山， 楊 娟， 劉勇華

(黃河科技學院，河南 鄭州 450005)

田薊苷是從唇形科香青蘭屬植物香青蘭DracocephalummoldevicaL.中提取得到的黃酮類活性成分[1]，具有降低冠脈血管阻力、抗腫瘤、保護心肌缺血/再灌注損傷、降血脂、脂肪肝、抗冠心病等藥理活性[2-4]，在防治心腦血管疾病方面應用前景廣闊，但該成分水溶性、脂溶性均較差[5-6]，灌胃給藥后絕對生物利用度僅為1.35%[7]，不利于其藥效充分發揮。目前，已報道的田薊苷相關劑型有固體分散體[6]、納米粒[8]等。

藥物與磷脂(主要是磷脂酰膽堿)形成復合物后，前者水溶性、脂溶性均可提高，也能為改善其生物利用度奠定基礎[9-10]；后者是一種混合物，主要包括磷脂酰膽堿、溶血磷脂酰膽堿等[11-12]，但溶血磷脂酰膽堿具有溶血等副作用[13]，故以其制備磷脂復合物時可能存在一定安全隱患，而磷脂酰膽堿是細胞膜主要成分，安全性高[14]。因此，本實驗制備田薊苷-磷脂酰膽堿復合物[15-16]，并考察其體內藥動學，以期為后續相關研究奠定實驗基礎。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1100型高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；MYP13-2S型磁力攪拌器(上海梅穎浦儀器儀表有限公司)；EX125DZH型電子天平[奧豪斯儀器(上海)有限公司]；RE-3000型旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠)；JXDC-10型氮吹儀(拓赫機電科技上海有限公司)；XPert-3型X射線衍射儀(馬爾文帕納科公司)。

1.2 試劑與藥物 田薊苷原料藥(批號191015P，純度97.1%，成都昂賽思生物科技有限公司)；田薊苷對照品(批號E-1170，純度98.0%，上海詩丹德標準技術服務有限公司)；磷脂酰膽堿(批號200519，純度>98%，上海輔必成醫藥科技有限公司)。

2 方法

2.1 復合物制備 采用溶劑揮發法，稱取40 ℃真空過夜干燥的田薊苷100 mg和磷脂酰膽堿適量，置于圓底燒瓶中，加入50 mL四氫呋喃作為溶劑，在水浴中磁力攪拌至澄清，40 ℃真空旋蒸除去制備溶劑，即得(性狀為黃色黏稠狀流體)。

2.2 油制劑制備 取復合物適量，加入大豆油超聲處理30 s，即得(性狀為澄清透明狀流體)，密封。

2.3 HPLC法測定田薊苷含量

2.3.1 色譜條件 Agilent SB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相甲醇-0.2%磷酸(70∶30，超聲混勻)；體積流量1.0 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長328 nm；進樣量10 μL。

2.3.2 供試品溶液制備 取復合物10 mg，置于100 mL量瓶中，甲醇超聲溶解并定容至100 mL，精密量取1 mL至10 mL量瓶中，甲醇定容至10 mL，混勻，即得。

2.3.3 線性關系考察 取田薊苷對照品約20 mg，精密稱定，置于50 mL量瓶中，加入10 mL四氫呋喃溶解，甲醇定容至刻度，搖勻，即得對照品溶液(每1 mL含0.4 mg田薊苷)，流動相稀釋至10.0、5.0、1.0、0.5、0.1、0.05 μg/mL，在“2.3.1”項色譜條件下進樣測定。以對照品質量濃度為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標(Y)進行回歸，得方程為Y=16.814 2X+0.397 5(r=0.999 9)，在0.05～10.0 μg/mL范圍內線性關系良好。

通過對交通、規劃和道路現狀進行分析，認為16號線上林路站設置在1號線二期車站南側的方案一合理可行。該方案客流吸引較均勻，線路走行于規劃橋樁中間，對既有高架橋影響較小。故方案一可作為推薦方案。

2.3.4 方法學考察 取復合物適量，按“2.3.2”項下方法平行制備6份供試品溶液，在“2.3.1”項色譜條件下進樣測定，測得田薊苷含量RSD為1.67%，表明該方法重復性良好。取供試品溶液適量，于0、3、6、9、12、24 h在“2.3.1”項色譜條件下進樣測定，測得田薊苷峰面積RSD為0.64%，表明溶液在24 h內穩定性良好。取0.05、1.0、10.0 μg/mL對照品溶液，在“2.3.1”項色譜條件下進樣測定6次，測得田薊苷峰面積RSD分別為0.52%、0.28%、0.32%，表明儀器精密度良好。稱取9份復合物，每份約5 mg，置于100 mL量瓶中，每3份為1組，分別加入0.4 mg/mL對照品溶液3、4.5、6 mL，在“2.3.1”項色譜條件下進樣測定，測得田薊苷平均加樣回收率分別為99.36%、99.17%、100.82%，RSD分別為0.93%、1.14%、0.80%。

2.4 復合率測定 精密稱取復合物10 mg，加入約5 mL正丁醇溶解，過0.22 μm微孔濾膜以除去未參加復合的田薊苷，收集濾液，減壓旋蒸除去正丁醇，按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.3.1”項色譜條件下進樣測定參加復合的田薊苷質量X1；另精密稱取復合物10 mg，按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.3.1”項色譜條件下進樣測定田薊苷總含量X0，計算復合率，公式為復合率=(X1/X0)×100%。

2.5 Box-Behnken效應面法 在前期研究基礎上，選擇磷脂酰膽堿用量(X1)、水浴溫度(X2)、攪拌時間(X3)作為影響因素，復合率(Y)作為評價指標，因素水平見表1。

表1 因素水平

2.6 晶型分析 采用X射線粉末衍射(XRPD)，條件為Cu-Kα靶；掃描范圍(2θ)4°～43°；掃描速度8°/min。取田薊苷、磷脂酰膽堿、物理混合物(田薊苷+磷脂酰膽堿)、復合物適量，置于玻璃槽中，玻璃片壓制平整，進行掃描。

2.7 表觀溶解度測定 取過量田薊苷、物理混合物、復合物，加入蒸餾水，超聲處理15 min(底部仍可見未溶解的原料藥)，25 ℃磁力攪拌48 h，取上層混懸液，8 000 r/min離心20 min，取上清液，在“2.3.1”項色譜條件下進樣測定田薊苷在水中的溶解度。同法測定該成分在正辛醇中的溶解度。

2.8 穩定性考察 取油制劑適量，置于溫度30 ℃、相對濕度65%的恒溫恒濕箱中，于0、1、3、6、9、12、18、24、30、45、60、75、90 d各取樣1 mL，過0.22 μm微孔濾膜，在“2.3.1”項色譜條件下進樣測定，考察田薊苷含量變化。

2.9 藥動學研究

2.9.1 混懸液制備 取田薊苷及其復合物適量，加入0.5%CMC-Na溶液，超聲處理30 s，即得(田薊苷質量濃度約為10 mg/mL)。

2.9.2 分組、給藥及采血 取禁食12 h的大鼠18只，隨機分為3組，每組6只，按照體質量分別灌胃給予“2.9.1”項下2種混懸液和油制劑，劑量均為50 mg/kg，于0.5、1、1.5、2、3、4、5、6、8、10、12 h玻璃毛細管(肝素浸潤)眼眶采血各約0.2 mL，置于肝素鈉浸潤過的離心管中，混勻后3 000 r/min離心2 min，取上層血漿，保存于冰箱的冷凍層中。

2.9.3 血漿處理 參考文獻[6,17]報道，取100 μL血漿樣品，置于1.5 mL離心管中，加入0.5 mL乙腈，密封后渦旋3 min，8 000 r/min離心10 min，取上清液，40 ℃氮氣吹干，加入100 μL乙腈，超聲處理10 s，取適量至帶有內襯管的進樣小瓶中待測。

2.9.4 線性關系考察 取田薊苷對照品適量，乙腈依次稀釋至3 000、1 500、500、100、50、20 ng/mL，分別取100 μL，置于1.5 mL離心管中，40 ℃氮氣吹干得殘渣，加入100 μL空白血漿，渦旋2 min后超聲處理1 min，得3 000、1 500、500、100、50、20 ng/mL血漿對照品溶液，按“2.9.3”項下方法處理，在“2.3.1”項色譜條件下進樣測定。以對照品質量濃度為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標(Y)進行回歸，得方程為Y=1.305 6X+0.687 3(r=0.991 9)，在20～3 000 ng/mL范圍內線性關系良好。

2.9.5 方法學考察 取血漿樣品適量，室溫下于0、3、6、9、12、24 h在“2.3.1”項色譜條件下進樣測定，測得田薊苷峰面積RSD為7.13%，表明樣品在24 h內穩定性良好。取20、500、3 000 ng/mL血漿對照品溶液適量，同一天內在“2.3.1”項色譜條件下進樣測定6次，測得田薊苷峰面積RSD分別為4.89%、5.06%、3.17%，表明該方法日內精密度良好；同法每天測定1次，連續6 d，測得其峰面積RSD分別為9.04%、4.71%、6.94%，表明該方法日間精密度良好。取上述3種質量濃度血漿對照品溶液適量，按“2.9.3”項下方法處理，在“2.3.1”項色譜條件下進樣測定，測得田薊苷平均加樣回收率分別為89.10%、94.44%、91.67%，RSD分別為7.01%、8.17%、6.43%。

2.9.6 數據處理與統計學分析 采用實測值計算tmax、Cmax，梯形法計算AUC。tmax組間比較采用非參數法秩和檢驗；Cmax、AUC經對數轉換后，組間比較采用獨立樣本t檢驗。P<0.05表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 制備工藝優化 按照表1因素水平制備復合物，中心點試驗設置5組，共17組，結果見表2。

表2 試驗設計與結果(n=3)

表3 方差分析

響應面分析見圖1，可知當固定某一因素時，其他2個因素對復合率的影響均呈先升后降的趨勢。設置復合率最大值為100%(期望值)，最小值為60.6%，得到最優工藝為磷脂膽酰堿用量176.6 mg，水浴溫度49.06 ℃，攪拌時間4.59 h，復合率為99.9%，根據實際可操作性，將其修正為磷脂膽酰堿用量177 mg，水浴溫度49 ℃，攪拌時間4.6 h。按上述優化工藝平行制備3份復合物，測得復合率分別為99.6%、99.9%、99.8%，平均值為99.8%，與預測值99.9%接近，表明該工藝穩定可行。另外，田薊苷與磷脂酰膽堿比例約為1∶1。

3.2 晶型分析 圖2顯示，田薊苷在10.5°、12.2°、14.3°、14.7°、24.9°等處可見其本身特征晶型峰；磷脂酰膽堿在5.5°附近可見其本身特征晶型峰；物理混合物仍可見田薊苷、磷脂酰膽堿特征晶型峰；復合物中田薊苷、磷脂酰膽堿特征晶型峰均完全消失，表明它是不同于物理混合物的一種物質[18-19]，以無定型狀態存在。

3.3 表觀溶解度測定 表4顯示，復合物在水、正辛醇中的表觀溶解度分別提高了10.50、16.66倍；由于磷脂酰膽堿是一種表面活性劑，故物理混合物在2種溶劑中的表觀溶解度也有所提高，但程度遠低于復合物。

表4 各樣品表觀溶解度測定結果

3.4 穩定性考察 圖3顯示，田薊苷質量濃度在90 d內無明顯變化，表明油制劑穩定性良好，并且無任何沉淀。

3.5 藥動學研究 圖4、表5顯示，與原料藥比較，復合物及其油制劑tmax、t1/2延長(P<0.01)，Cmax、AUC0～t、AUC0～∞升高(P<0.01)，以油制劑更明顯(P<0.01)，口服生物利用度分別提高至2.53、5.38倍。

表5 田薊苷主要藥動學參數

4 討論與結論

預實驗對磷脂酰膽堿用量(150～200 mg)、水浴溫度(25～65 ℃)、攪拌時間(2～8 h)進行了考察，在不影響磷脂酰膽堿穩定性的前提下，選擇合適的制備溫度及攪拌時間，并采用Box-Behnken響應面法優化處方工藝。結果，所得復合物的復合率基本接近100%。

田薊苷-磷脂酰膽堿復合物混懸劑促進了藥物吸收，可能是由于改善其溶解度所致；油制劑具有更高的生物利用度，可能是因為藥物與磷脂酰膽堿之間的作用力比較弱，在水中容易重新解離，降低了促吸收作用，而制成該劑型后可使復合物免受水相等因素干擾，增加了穩定性，并且其口服后在胃腸道蠕動的作用下可能會形成微乳、自微乳、膠束等[20-21]，從而進一步促進藥物吸收。另外，tmax顯著延長，可能是因為油制劑對溶解于其中的藥物釋放具有一定阻滯作用。

綜上所述，本實驗所制備的田薊苷-磷脂酰膽堿復合物與前期報道的固體分散體[6]、PLGA納米粒[8]等劑型比較，在生物利用度提高程度方面有一定優勢，并且其處方及工藝均較簡單。同時，它可改善藥物的脂溶性，也能為高包封率的納米制劑研究奠定基礎[22-23]。