知母皂苷對葛根素在正常、糖尿病大鼠體內藥動學的影響

黃海蘭， 王 浩， 劉奕明,2， 林愛華

(1.廣州中醫藥大學第二附屬醫院I期臨床研究室，廣東 廣州 510120；2.廣州中醫藥大學第二附屬醫院，廣東省中醫證候臨床研究重點實驗室，廣東 廣州 510120；3.廣州中醫藥大學第二附屬醫院珠海醫院，廣東 珠海 519000)

葛根為豆科植物野葛或甘葛藤的干燥根，被用于治療糖尿病及其并發癥[1]，葛根素為其主要有效成分，可通過抑制胰島細胞凋亡、上調胰島素分泌[2]來降低血糖，同時具有保護心腦血管、抗炎等藥理活性[3]，但它為P-糖蛋白(P-gp)底物[4]，水溶性、脂溶性均較低，大部分以原型從糞便排泄，絕對口服生物利用度僅約為7%[5]，限制了口服給藥的臨床應用，而注射液又易導致溶血和過敏反應[6]。因此，有必要探索更方便有效的方法來增加葛根素口服吸收。

葛根-知母為經典的治療糖尿病藥對，兩藥配伍兼具清熱生津、滋陰潤燥之功效[7]。知母皂苷為知母主要藥理活性物質，可通過抑制TNF-α釋放、上調細胞中IRS-1蛋白表達來改善高血糖[8]，對芒果苷在大鼠體內的吸收有明顯促進作用[9]，但對葛根素是否有類似影響目前尚不明確。因此，本實驗考察知母皂苷對葛根素在正常、糖尿病大鼠體內藥動學的影響，評價該成分促吸收作用，以期為葛根-知母藥對臨床應用提供依據。

1 材料

1.1 儀器 TRIPLE QUADTM5500 型液相色譜-質譜聯用儀(LC-MS/MS)，配置Turbo Ionspray離子源(ESI)、LC-30AD高效液相色譜儀(日本島津公司)、Analyst 1.7數據處理系統(美國AB公司)；5418R高速冷凍離心機(德國Eppendorf公司)；VX-Ⅱ多管渦旋振蕩器(北京踏錦科技有限公司)；MS105DU電子天平[十萬分一，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)]；N-EVAP24進口氮吹儀(美國Organomation公司)。

1.2 試劑與藥物 葛根素對照品(批號MUST-21010610，純度>98%)，購自成都曼思特生物科技有限公司；蘆丁對照品(批號O0714AS，純度>98%)，購自大連美侖生物技術有限公司；知母皂苷凍干粉，實驗室自制。肝素鈉，購自上海如吉生物科技有限公司；鏈脲佐菌素(批號111607-200301，純度≥98%)，購自美國Sigma公司。AB-8大孔吸附樹脂，購自廣州松洲國熙有限公司。知母(批號170408241，產地河北)，購自廣東康美藥業股份有限公司，經專家鑒定為正品。高糖高脂飼料(基礎飼料52.2%，蔗糖20%，豬油15%，酪蛋白10%，膽固醇1.2%，磷酸氫鈣0.6%，石粉0.4%，預混料0.4%)。甲醇、乙腈均為色譜純，購自美國默克公司；甲酸為分析純，購自上海麥克林生化科技有限公司；水為超純水，經Milli-Q系統設備制備。

1.3 動物 SPF級SD大鼠，雄性，購自南方醫科大學，體質量180～220 g，合格證號44002100028394，動物生產許可證號SCXK(粵)2016-0041。

2 方法

2.1 對照品、內標溶液制備

2.1.1 對照品溶液 精密稱取葛根素對照品2.00 mg，甲醇溶解并定容，制成0.2 mg/mL貯備液，在-30 ℃下保存，用時甲醇依次稀釋至0.05、0.1、0.5、1、5、10、20、50 μg/mL，分別精密吸取10 μL，90 μL空白血漿制成質量濃度為5、10、50、100、500、1 000、2 000、5 000 ng/mL的溶液，即得。

2.1.2 內標溶液 精密稱取蘆丁對照品2.20 mg，甲醇溶解并定容，制成0.22 mg/mL貯備液，在-30 ℃下保存，用甲醇稀釋至2.2 μg/mL，即得。

2.2 藥液制備

2.2.1 知母皂苷 參考文獻[9-10],取適量知母根莖粉碎，過60目篩，75%乙醇分別按料液比1∶8、1∶6各提取1次，每次1 h，趁熱過濾，濾液濃縮至無醇味，離心后將上清液用AB-8大孔吸附樹脂進行純化，洗脫體積流量為3 mL/min，分別以3倍柱體積純水、6倍柱體積NaOH洗脫后，純水洗脫至中性，20%、80%乙醇繼續洗脫，收集80%乙醇洗脫液，濃縮至無醇味后凍干成粉末，醋酐-濃硫酸反應呈藍綠色，表明所純化有效部位為甾體皂苷，外標法[11]測得知母皂苷B2含量為87.7%，0.5%CMC-Na稀釋至所需質量濃度，即得。

2.2.2 葛根素 精密稱取葛根素對照品適量，0.5%CMC-Na稀釋至10 mg/mL，即得。

2.3 糖尿病大鼠模型建立 12只正常大鼠適應性喂養普通飼料3 d后，再采用高糖高脂飼料喂養28 d。于第28天禁食不禁水12 h后，大鼠腹腔注射30 mg/kg鏈脲佐菌素，于給藥后第3、7天檢測空腹血糖(FBG),以FBG≥16.7 mmol/L為合格。

2.4 分組、給藥與采血 24只正常大鼠隨機分為4組，每組6只，給藥前禁食不禁水12 h，分別灌胃給予葛根素(100 mg/kg)及葛根素-低、中、高劑量知母皂苷(50、100、200 mg/kg)混合藥液；12只糖尿病大鼠隨機分為2組，每組6只，分別灌胃給予葛根素及葛根素-知母皂苷(100 mg/kg)混合藥液，于給藥前和給藥后0.083、0.167、0.33、0.5、1、2、3、4、6、8、10、12、24 h眼眶采血各500 μL，置于含肝素鈉的EP管中，4 ℃、3 000 r/min離心15 min，取上層血漿，置于-80 ℃冰箱中保存待測。

2.5 LC-MS/MS條件

2.5.1 色譜 Inertsil ODS-3色譜柱(2.1 mm×100 mm，3 μm)；流動相0.1%甲酸(A)-乙腈(B)，梯度洗脫(0～1 min，5%B；1～2 min，5%～30%B；2～4 min，30%～70%B；4～5 min，70%～5%B；5～7 min，5%B)；體積流量0.3 mL/min；柱溫40 ℃；進樣量5 μL。

2.5.2 質譜 電噴霧離子源(ESI)；霧化溫度450 ℃；噴霧電壓(IS)-4 500 V；氣簾氣(CUR)20；碰撞氣(CAD)7；氮氣1(GS1)40；氮氣2(GS2)50；負離子多反應檢測模式(MRM)；定量離子對葛根素m/z415.1～295.1，蘆丁m/z609.3～271.0。

2.6 血漿處理 血漿在室溫下融化后取100 μL至EP管中，加入20 μL內標溶液，振蕩10 s，再加入400 μL乙腈沉淀蛋白，振蕩3 min，4 ℃、13 000 r/min離心15 min，取360 μL上清液，氮氣吹干，吹干物用200 μL乙腈-水(30∶70)復溶，振蕩3 min，微孔濾膜過濾，測定時進樣5 μL作LC-MS/MS分析。

（3）樁孔必須挖一節、澆筑一節護壁，護壁高度一般為1m，嚴禁不及時澆筑護壁的冒險作業。對軟弱地層、涌水涌沙地層，護壁節段高度可減少 0.3～0.5m。

2.7 數據處理與統計學分析 采用DAS 2.0軟件中的非房室模型計算AUC、Cmax、Tmax、t1/2等主要藥動學參數，其中Cmax，Tmax為實測值，AUC以梯形法測定。再通過SPSS 25.0軟件進行統計學處理，多組間比較采用單因素方差分析，2組間比較采用t檢驗。P<0.05表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 方法學考察

3.1.1 專屬性試驗 取空白血漿、空白血漿+對照品(5 ng/mL)+內標、給藥24 h后血漿適量，按“2.6”項下方法處理，在“2.5”項條件下進樣測定，結果見圖1。由此可知，葛根素測定不受內源性物質影響，表明該方法專屬性良好。

3.1.2 線性關系考察 取含藥血漿適量，按“2.6”項下方法處理，在“2.5”項條件下進樣測定。以對照品、內標峰面積比值(Y)對血藥濃度(X)進行回歸，得方程為Y=0.011 5X+0.011 4(r=0.997 4)，在5～5 000 ng/mL范圍內線性關系良好，定量下限為5 ng/mL。

3.1.3 精密度、準確度試驗 分別配制含定量下限及低、中、高(10、200、4 000 ng/mL)質量濃度葛根素的質控血漿，按“2.6”項下方法處理，同一天內在“2.5”項條件下進樣測定6次，考察日內精密度；同法每天測定1次，連續3 d，考察日間精密度，測得兩者RSD分別不大于6.98%、7.47%。再以實測、真實質量濃度比值考察準確度，測得其數值在96.97%～103.21%范圍內，均符合生物樣品分析要求。

3.1.4 提取回收率、基質效應試驗 配制含“3.1.3”項下3個質量濃度葛根素的質控血漿各6份，按“2.6”項下方法處理，在“2.5”項條件下進樣測定，計算峰面積A1；取空白血漿適量，按“2.6”項下方法處理，其殘留物用含5、100、2 000 ng/mL葛根素的乙腈-水(30∶70)復溶，在“2.5”項條件下進樣測定，計算峰面積A2；將5、100、2 000 ng/mL對照品溶液溶于乙腈-水(30∶70)中，在“2.5”項條件下進樣測定，計算峰面積A3，以A1/A2為提取回收率，A2/A3為基質效應，測得兩者分別在88.94%～91.85%、96.32%～109.13%范圍內，均符合生物樣品分析要求。

3.1.5 穩定性試驗 配制含“3.1.3”項下3個質量濃度葛根素的質控血漿，室溫放置4 h，考察其室溫穩定性；在-80 ℃下反復凍融3次，考察其凍融穩定性；在4 ℃進樣器中放置24 h，考察其待測液穩定性；在-80 ℃冰箱中放置30 d，考察其長期穩定性，以當天標準曲線衡量的質量濃度并計算其準確度，測得其數值均在89.27%～110.00%范圍內，表明葛根素在不同條件下穩定性良好。

3.2.1 正常大鼠 圖2、表1顯示，葛根素單一給藥后Tmax較短，各時間點血藥濃度較低；合用各劑量知母皂苷后葛根素Cmax、AUC0-∞升高(P<0.05)，CLZ/F下降(P<0.05)，提示知母皂苷可增加葛根素在正常大鼠體內的暴露水平，并降低后者消除速率。

表1 正常大鼠中葛根素主要藥動學參數

3.2.2 糖尿病大鼠 圖3、表2顯示，與表1比較，葛根素Cmax、AUC0～t、AUC0～∞降低(P<0.05)，與文獻[12]報道一致；合用知母皂苷后，葛根素Cmax、AUC0～t、AUC0～∞升高(P<0.01)，Tmax延長(P<0.05)，CLZ/F、VZ/F降低(P<0.01)，提示知母皂苷可增加葛根素體內暴露水平，并延遲后者吸收，降低后者消除速率。

表2 糖尿病大鼠中葛根素主要藥動學參數

4 討論與結論

在樣品前處理過程中發現，乙酸乙酯萃取時提取回收率低，固相萃取時價格昂貴，而乙腈萃取時蛋白信號強。因此，選擇乙腈作為提取溶劑。

研究表明，胡椒堿[13]、維拉帕米[14]可抑制CYP450酶、P-gp活性，減少葛根素代謝和外排，增加其體內血藥濃度；知母皂苷BⅡ抑制藥物代謝酶的作用較弱[15]，對P-gp活性的影響尚不明確。本實驗發現，葛根素在糖尿病大鼠中的血藥濃度降低，可能與糖尿病狀態下Ⅱ相代謝酶UGT1a1、UGT1a7活性上升[12,16]，與葛根素代謝加快有關；知母皂苷對葛根素的吸收促進作用更強，可能與該成分在正常、病理狀態下對葛根素吸收、代謝等過程的影響程度不同有關。

本實驗中葛根素給藥劑量參考文獻[17]，并根據玉液湯[18]、芪參玉液膠囊[19]中知母與葛根1∶1的比例，探討在該比例下知母皂苷對葛根素藥動學的影響，并對兩者以0.5∶1、2∶1比例配伍時進行相關考察，發現各劑量組無顯著差異。前期報道，葛根素能延緩糖尿病并發癥的發展[20]，提示知母皂苷增加該成分體內暴露量時，有利于它發揮上述作用，并且其劑量過高時的吸收存在自身濃度抑制現象[21]，故通過配伍等方式增加其吸收尤為重要。

綜上所述，本實驗研究知母皂苷對葛根素在大鼠體內藥動學的影響，可為葛根-知母藥對臨床應用提供依據。另外，知母皂苷B2能促進芒果苷吸收[22]，而本實驗所用的知母皂苷也主要為該類型，同樣可促進葛根素吸收，提示它有望成為促吸收中藥的成分，其機制有待進一步研究。