一測多評法同時測定連翹歸尾顆粒中3種成分

遆安航， 李思思， 陳 瑾， 翟康欣， 譚麗媛， 張淑蓉

(山西中醫藥大學，山西 晉中 030600)

連翹歸尾煎出自《景岳全書》，由連翹、歸尾、甘草、金銀花、紅藤組成，功效清熱解毒、活血消腫[1]，可治療乳癰、口疽、頰瘍、牙癰、豬丹毒等[2]，方中連翹、金銀花為君藥，具有清熱解毒、散結消腫作用[3]。課題組前期發現，該方在體內外實驗中均顯示對乳腺癌細胞的抑制作用，為了更有效地開展后期研究，保證實驗樣本前后的一致性，已將其改制成顆粒劑[4]。

為了降低檢測成本，同時結合中藥中多種成分相互作用、復雜多變等特點[5]，采用一測多評法測定多指標成分含量已成為發展趨勢和研究熱點[6]。因此，本實驗建立該方法同時測定連翹歸尾顆粒中連翹酯苷A、綠原酸、連翹苷的含量[7]，以期為該制劑質量控制和評價提供參考。

1 材料

1.1 儀器 數顯電熱套購自金壇市杰瑞爾電器有限公司(型號HDM500-10450)；中藥材粉碎機購自廣州真麥機械設備有限公司(型號LG-50)；恒溫水浴鍋購自上海比朗儀器制造有限公司(型號HH-2)；旋轉蒸發儀購自鞏義市英峪弘源儀器廠(型號RE-5205)；超聲波清洗機購自杭州法蘭特超聲波科技有限公司(型號SB-5200 DTDN)；高效液相色譜儀購自杭州瑞析科技有限公司(型號Waters e2695)、上海諾析儀器有限公司(型號Agilent 1260)；電動噴霧器購自武漢藥科新技術開發有限公司(型號CS-1020E)；電子天平(十萬分之一)購自瑞士梅特勒-托利多公司(型號AE240)。

1.2 試劑與藥物 連翹歸尾顆粒(批號201020、201121、201222)及各陰性顆粒均為自制。綠原酸(批號110753-201716，純度>98%)、連翹酯苷A(批號111810-201606，純度>98%)、連翹苷(批號110821-200610，純度>98%)對照品及連翹(批號120908-201216)、金銀花(批號121060-201608)、甘草(批號120904-201605)、大血藤(批號121353-201704)對照藥材均購自中國食品藥品檢定研究院。乙腈為色譜純(河南薩默生物科技有限公司)；甲酸、甲醇為分析純；水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 Thermo Scientific BDS HYPERSIL C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相乙腈(A)-0.1%甲酸(B)，梯度洗脫(0～6 min，5%～9%A；6～9 min，9%～12%A；9～22 min，12%～14%A；22～35 min，14%～24%A；35～40 min，24%～26%A)；體積流量1.0 mL/min；柱溫25 ℃；檢測波長278 nm；進樣量10 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 供試品溶液 精密稱取本品粉末(過6號篩)2 g，置于具塞錐形瓶中，加20%乙醇10 mL，密塞，浸泡40 min，稱定質量，超聲(功率250 W、頻率45 kHz)處理45 min，放冷，20%乙醇補足減失的質量，搖勻，濾過，0.45 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.2.2 對照品溶液 精密稱取連翹酯苷A、連翹苷、綠原酸對照品適量，置于5 mL量瓶中，50%甲醇定容至刻度，搖勻，即得(三者質量濃度分別為0.538、0.066、0.222 mg/mL)，在4 ℃下保存。

2.2.3 陰性樣品溶液 將缺連翹、缺金銀花和大血藤陰性樣品研成粉末，過6號篩，分別精密稱取2 g，按“2.1.2”項下方法制備，即得。

2.3 專屬性考察 取“2.2”項下供試品、對照品、陰性樣品溶液適量，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，結果見圖1。由此可知，各成分色譜峰均能達到基線分離，表明該方法專屬性良好。

2.4 線性關系考察 分別精密量取“2.2.2”項下對照品溶液4、8、16、24、32、40 μL，置于2 mL量瓶中，50%甲醇定容至刻度，搖勻，得不同質量濃度，在“2.1”項色譜條件下進樣測定。以對照品峰面積為縱坐標(Y)，質量濃度為橫坐標(X)進行回歸，得方程分別為連翹酯苷AY=888 061X-51 410(r=0.999 9)，線性范圍1.08～10.76 μg/mL；連翹苷Y=747 692X-3 710(r=1.000 0)，線性范圍0.13～1.32 μg/mL；綠原酸Y=1 798 549X-26 262(r=0.999 9)，線性范圍0.44～4.44 μg/mL，均呈現良好的線性關系。

2.5 精密度試驗 精密量取“2.2.2”項下對照品溶液16 μL，置于2 mL量瓶中，50%甲醇定容至刻度，搖勻，在“2.1”項色譜條件下進樣測定6次，測得連翹酯苷A、連翹苷、綠原酸峰面積RSD分別為0.16%、0.07%、0.48%，表明儀器精密度良好。

2.6 重復性試驗 將同一批本品(批號201020)研成粉末，過6號篩，精密稱取6份，每份2 g，按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，測得連翹酯苷A、連翹苷、綠原酸含量RSD分別為2.88%、2.22%、2.65%，表明該方法重復性良好。

2.7 穩定性試驗 將本品(批號201020)研成粉末，過6號篩，精密稱取2 g，按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，置于4 ℃冰箱中保存，每隔4 h取出，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，測得連翹酯苷A、連翹苷、綠原酸峰面積RSD分別為0.58%、1.03%、2.47%，表明溶液在24 h內穩定性良好。

2.8 加樣回收率試驗 將各成分含量已知的本品(批號201020)研成粉末，過6號篩，精密稱取1 g，置于錐形瓶中，精密加入適量對照品溶液，平行9份，按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，計算回收率[8]，結果見表1。

表1 各成分加樣回收率試驗結果(n=9)

2.9 相對校正因子計算 精密量取“2.2.2”項下對照品溶液5、10、15、20、30 μL，置于2 mL量瓶中，50%甲醇定容至刻度，搖勻，得不同質量濃度，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，以連翹酯苷A為內標，計算其他2種成分相對校正因子fk/s[9]，公式為fk/s=fk/fs=(CkAs)/(CsAk)，其中Ck為其他成分含量，Ak為其他成分峰面積，Cs為內標含量，As為內標峰面積，結果見表2。

表2 各成分相對校正因子

2.10 不同儀器、色譜柱對相對校正因子的影響 分別采用Agilent 1260型、Waters e2695型色譜儀，以及Thermo Scientific BDS HYPERSIL C18、Hypersil BDS C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，按“2.9”項下方法計算相對校正因子，平行6次，結果見表3，可知均無明顯影響(RSD<3%)。

表3 不同儀器、色譜柱對相對校正因子的影響

2.11 色譜峰定位 考察了“2.10”項下儀器、色譜柱對相對保留時間的影響，結果見表4，可知均無明顯影響(RSD<3%)。

表4 不同儀器、色譜柱對相對保留時間的影響

2.12 樣品含量測定 取3批樣品，按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，各平行3份，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，分別采用外標法、一測多評法計算含量，結果見表5。由此可知，2種方法所得結果接近[相對誤差(RE)<1%]，表明一測多評法可用于含量測定。

3 討論

現代藥理研究表明，連翹酯苷A、連翹苷具有抗菌、抗衰老等作用[10-12]，綠原酸具有抗內毒素、抗腫瘤等作用[13-14]，均與連翹歸尾煎功能主治相符。由于連翹酯苷A在HPLC色譜圖中的出峰位置位于綠原酸和連翹苷的中間，并且性質較穩定，故本實驗以其為內標進行含量測定。

本實驗考察了流動相乙腈-0.2%甲酸、乙腈-0.1%甲酸的分離效果，發現以乙腈-0.1%甲酸洗脫時各成分基線分離較好，符合實驗要求。

4 結論

目前，有關一測多評法的報道大多是測定同一味藥中同一種類成分的含量[15-16]，而本實驗測定了連翹歸尾顆粒中不同種類成分的含量，并且該方法具有專屬度高、重復性好、穩定性強、快速簡便、節約成本等優點，可為該制劑質量控制和評價提供參考依據。