基于標準湯劑的槲寄生配方顆粒質量標準研究

張智遠， 丁 潔， 曹桂云， 李媛媛， 耿紹軒， 孟兆青*， 劉玉紅,3*

(1.山東中醫藥大學藥學院，山東 濟南 250355；2.山東宏濟堂制藥集團股份有限公司，山東 濟南 250103；3.山東省高校中藥質量控制與全產業鏈建設協同創新中心，山東 濟南 250355)

槲寄生為桑寄生科植物槲寄生Viscumcoloratum(Komar.)Nakai的干燥帶葉莖枝[1-2]，具有抗腫瘤、抗氧化、抗骨質疏松等藥理作用，而且不良反應少，來源廣泛，開發價值高[3-5]。

中藥配方顆粒以炮制規范的單味中藥材為原材料，充分運用現代工藝進行制備，既能保證與傳統湯劑一樣隨證加減，還可規避后者攜帶不便、煎煮麻煩等缺點，在一定程度上推動了劑型改革創新的進程，但市售品質量良莠不齊，故加強其質量控制非常重要[6]。國家藥典委員會于2016年發布《中藥配方顆粒質量控制與標準制定技術要求(征求意見稿)》，指出中藥配方顆粒應以標準湯劑為與臨床湯劑療效基本一致的標準參照物，并明確以出膏率、指標成分的含量及轉移率、特征圖譜等指標為表征，從而進一步衡量兩者一致性[7-10]。因此，本實驗基于標準湯劑對槲寄生配方顆粒質量標準進行研究，以期為探討其代替傳統湯劑的可行性和質量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1290超高效液相色譜儀、Agilent 1200高效液相色譜儀(美國Agilent Technologies公司)；Waters e2695高效液相色譜儀(美國Waters公司)；TS8606凍干機(德國Fevik公司)；KQ-250DE型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；CP225D電子天平[賽多利斯科學儀器(北京)有限公司]。

1.2 試劑與藥物 紫丁香苷對照品(批號111574-201605，中國食品藥品檢定研究院，純度95.2%)。槲寄生配方顆粒(每1 g相當于3.5 g藥材，批號210601、210602、210603，由藥材S5標準湯劑制備，山東宏濟堂制藥集團股份有限公司)。15批藥材具體信息見表1，經山東中醫藥大學徐凌川教授鑒定為桑寄生科植物槲寄生Viscumcoloratum(Komar.)Nakai的干燥帶葉莖枝，根據《中藥配方顆粒質量控制與標準制定技術要求》(征求意見稿)要求結合現代臨床用藥習慣制備標準湯劑，方法為取各批藥材100 g，煎煮2次，第1次加10倍量水浸泡30 min，武火煮沸后改為文火煎煮1 h；第2次加8倍量水，武火煮沸后改為文火煎煮40 min，趁熱過濾，合并2次濾液，即得，再經濃縮、冷凍干燥制成凍干粉。甲醇為色譜純(國藥集團化學試劑有限公司)；磷酸為色譜純(美國Fisher Scientific公司)；甲醇為分析純(天津市富宇精細化工有限公司)；水(杭州娃哈哈集團有限公司)。

表1 樣品信息

2 方法與結果

2.1 紫丁香苷含量測定

2.1.1 溶液制備

2.1.1.1 對照品溶液 精密稱取紫丁香苷對照品適量，甲醇制成25 μg/mL溶液，即得。

2.1.1.2 供試品溶液 取配方顆粒、標準湯劑凍干粉適量，研細，取粉末約0.3 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入25 mL70%甲醇，稱定質量，超聲處理30 min，放冷，70%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得配方顆粒、標準湯劑供試品溶液；取藥材約1 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入25 mL 50%甲醇，稱定質量，超聲處理30 min，冷卻，50%甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得藥材供試品溶液。

2.1.2 色譜條件與系統適用性試驗 Waters Atlantis T3色譜柱，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)；流動相甲醇-0.1%磷酸(12∶88，40 min)；體積流量0.3 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長264 nm。精密吸取對照品、供試品溶液各1 μL，在上述色譜條件下進樣測定，結果見圖1，理論塔板數按紫丁香苷峰計，應不低于5 000。

2.1.3 線性關系考察 精密稱取紫丁香苷對照品10.97 mg，甲醇定容至200 mL，依次稀釋2、4、8、16倍，在“2.1.2”項色譜條件下進樣測定。以對照品質量濃度為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標(Y)進行回歸，得方程為Y=6.148 1X-0.052 7(r=1.000 0)，在3.26～52.20 μg/mL范圍內線性關系良好。

2.1.4 方法學考察

2.1.4.1 重復性試驗 取配方顆粒6份，按“2.1.1”項下方法制備供試品溶液，在“2.1.2”項色譜條件下進樣測定，測得紫丁香苷峰面積RSD為1.06%，表明該方法重復性良好；

2.1.4.2 中間精密度試驗 不同分析人員在不同時間點進行試驗，測得紫丁香苷含量RSD為1.05%，同時不同儀器測得配方顆粒中該成分含量RSD為1.03%，表明儀器精密度良好。

2.1.4.3 穩定性試驗 取同一份供試品溶液，于0、2、4、6、8、12、24 h在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定，測得紫丁香苷峰面積RSD為1.35%，表明溶液在24 h內穩定性良好。

2.1.4.4 加樣回收率試驗 取6份配方顆粒粉末，每份約0.15 g，精密稱定，加入對照品溶液適量，按“2.1.1”項下方法制備供試品溶液，在“2.1.2”項色譜條件下進樣測定，計算回收率。結果，紫丁香苷平均加樣回收率為96.69%，RSD為3.75%。

2.1.4.5 耐用性試驗 采用不同品牌型號的色譜柱測定同一份供試品溶液，測得紫丁香苷含量RSD為1.73%，表明該方法耐用性良好。

2.1.5 結果分析 取15批藥材、標準湯劑、配方顆粒，按“2.1.1”項下方法制備供試品溶液，在“2.1.2”項色譜條件下進樣測定，計算出膏率、含量、轉移率，結果見表2，可知標準湯劑出膏率、轉移率較穩定，而含量具有一定離散性，主要是由于藥材差異所致。由表2可知，出膏率平均值為22.18%，22.18%±30%為15.52%～28.83%。因此，采用含量最大值、最小值制定紫丁香苷含量限度，公式為含量上限=配方顆粒制成量×出膏率上限×最大指標含量，即3.5×28.83%×2.73 mg/g=2.75 mg/g；含量下限=配方顆粒制成量×出膏率下限×最小指標含量，即3.5×15.52%×1.15 mg/g=0.62 mg/g，考慮到不同批次藥材的差異性及大生產的復雜性，最終確定為0.6～3.0 mg/g。

表2 各樣品出膏率、含量、轉移率測定結果

另外，3批配方顆粒中紫丁香苷含量符合相關要求；轉移率與標準湯劑(S5)接近，而且均在各標準湯劑變異可接受范圍內，表明該制劑制備工藝較合理。

2.2 標準湯劑HPLC特征圖譜建立

2.2.1 色譜條件與系統適用性試驗 Waters Atlantis T3色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相0.1%磷酸(A)-甲醇(B)，梯度洗脫(0～5 min，1%～2%B；5～41 min，2%～41%B)；體積流量1.0 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長264 nm；進樣量3 μL。以紫丁香苷峰為參照峰(S)，理論塔板數應不低于5 000，色譜圖見圖2。

2.2.2 方法學考察

2.2.2.1 精密度試驗 取“2.1.1”項下同一份供試品溶液，在“2.2.1”項色譜條件下進樣測定6次，測得各共有峰峰面積RSD為0.54%～0.92%，表明儀器精密度良好。

2.2.2.2 重復性試驗 取同一批標準湯劑，按“2.1.1”項下方法平行制備6份供試品溶液，在“2.2.1”項色譜條件下進樣測定，測得各共有峰峰面積RSD為0.44%～1.76%，表明該方法重復性良好。

2.2.2.3 穩定性試驗 取“2.1.1”項下同一份供試品溶液，于0、2、4、8、12、24 h在“2.2.1”項色譜條件下進樣測定，測得各共有峰峰面積RSD為0.17%～1.87%，表明溶液在24 h內穩定性良好。

2.2.3 圖譜生成 取“2.1.1”項下供試品溶液，在“2.2.1”項色譜條件下進樣測定，將數據導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(2012版)”，結果見圖3～4。以S1為參照，對15批藥材特征圖譜進行共有峰標識，并進行峰匹配，選擇出峰穩定，峰形、分離度較好的6個共有峰作為特征峰(峰5為紫丁香苷)；15批標準湯劑特征圖譜以S1為參照，多點校正后對共有峰進行Mark匹配，并進行相似度分析，結果見表3，可知除S1外其他批次標準湯劑的相似度均大于0.9，具有良好的相似度。

表3 15批標準湯劑相似度

以5號峰(紫丁香苷)為參照(S)，測得各共有峰相對保留時間RSD為0～0.72%，但相對峰面積差異較大，見表4。考慮到藥材在運輸、儲存等不同環節存在的其他因素，故不限定其特征圖譜的相對峰面積范圍。

2.2.4 聚類分析 將15批標準湯劑中各共有峰的峰面積進行量化處理，通過SPSS 20.0軟件進行聚類分析[11]，結果見圖5。由此可知，當刻度距離為20時，可分為2類，S2～S4、S6～S15聚為1類，S1、S5聚為1類，其中后兩者產地均為河南，并且紫丁香苷含量更高。

2.2.5 主成分分析 將15批標準湯劑中各共有峰的峰面積進行量化處理，通過SPSS 20.0軟件進行主成分分析[12-14]，以特征值>1為提取標準得到2個主成分，累積方差貢獻率為83.542%，可代表共有峰大部分信息，見圖6。圖7、表5顯示，S1、S5分布比較離散，與其他樣品差異較大，可能與紫丁香苷含量有關，與聚類分析結果一致。

表5 15批標準湯劑主成分分析得分系數矩陣

2.3 配方顆粒HPLC特征圖譜建立 在“2.2.1”項色譜條件下建立3批配方顆粒(210601，編號P1；210602，編號P2；210603，編號P3)、標準湯劑(S5)的HPLC特征圖譜，結果見圖8、表6～7。由此可知，3批配方顆粒特征圖譜均呈現與S5相同的6個共有峰，并且其相對保留時間、相對峰面積基本一致，均處于標準湯劑質量標準規定范圍內，符合要求；多點校正后進行共有峰Mark匹配，測得相似度分別為0.993、0.986、0.989，均大于0.98。

表6 3批配方顆粒、標準湯劑(S5)中共有峰相對保留時間

表7 3批配方顆粒、標準湯劑(S5)中共有峰相對峰面積

3 討論

紫丁香苷是槲寄生主要有效成分，專屬性較強[15-16]，故本實驗選擇該成分作為指標建立HPLC特征圖譜。

結果顯示，除S1外其他14批標準湯劑特征圖譜與對照圖譜的相似度均大于0.9，表明各批次之間相似度較好，并且3批配方顆粒特征圖譜均呈現與S5標準湯劑相同的6個共有峰。再依據配方顆粒與標準湯劑相對保留時間、相對峰面積、特征圖譜相似度評價結果進行量值傳遞評價[17-18]，發現其特征圖譜量值得到穩定傳遞，基本保證了配方顆粒與標準湯劑的一致性。

4 結論

本實驗以槲寄生標準湯劑出膏率、紫丁香苷含量及轉移率、特征圖譜為表征，衡量了槲寄生配方顆粒與標準湯劑的一致性，闡明了前者與藥材、標準湯劑在化學成分上的相關性，克服了依靠單一成分進行評價的缺點，能全面反映該制劑內在質量，為其替代傳統湯劑提供了研究基礎。