益腎化濕顆粒對抗Thy-1型腎炎大鼠腎組織中PCNA、Akt表達的影響

董王鈺， 楊 銳， 張春江， 許曉剛， 陶 林,2， 楊曉萍*

(1.石河子大學醫學院第一附屬醫院，新疆 石河子 832000；2.石河子大學醫學院，新疆 石河子 832000)

系膜增生性腎小球腎炎(mesangial proliferative glomerulonephritis，MsPGN) 是全球最常見的腎小球腎炎類型之一[1]，其基本病理特征為腎小球系膜細胞增殖和/或系膜細胞外基質沉積增多[2]。有研究表明，隨著系膜細胞增生程度的加重，蛋白尿、總膽固醇、甘油三脂可隨之升高，并伴隨血清白蛋白的降低[3]。因此，抑制系膜細胞增殖對改善MsPGN腎功能、延緩病程進展至關重要。既往研究表明，益腎化濕顆粒具有抑制氧化應激、炎癥、細胞凋亡、增殖的作用[4-5]。因此，本研究通過建立不可逆性抗Thy-1型MsPGN大鼠模型，觀察腎組織病理變化，檢測血清腎功能相關指標以及腎組織中PCNA、Akt蛋白和mRNA表達，探索益腎化濕顆粒對MsPGN疾病的治療作用及調控機制，并探討其與增殖的關系。

1 材料

1.1 動物 SPF級雄性SD大鼠60只，體質量(200±20)g，6周齡，購自新疆醫科大學動物實驗中心，實驗動物生產許可證號SCXK(新)2018-0002，實驗動物使用許可證號SYXK(新)2018-0003。大鼠飼養屏障環境為溫度(23±3)℃，相對濕度40%～70%，自由進食飲水。實驗經石河子大學倫理委員會批準[2020院倫理實字(177)號(No.01)]。

1.2 試劑與藥物 益腎化濕顆粒(批號20200503，10 g/袋)購自廣州康臣藥業有限公司，完全溶解于45 ℃生理鹽水中，配制成500 mg/mL藥液備用；纈沙坦分散片(批號20210112，80 mg/片)購自海南皇隆制藥股份有限公司，研磨成粉后溶解于45 ℃生理鹽水中，配制成2 mg/mL藥液。兔抗大鼠Thy1多克隆抗體、蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)(貨號bs-6951R)、p-Akt (Thr308)(貨號bs-2720R)、增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)(貨號bs-2007R)抗體購自北京博奧森生物技術有限公司；尿蛋白定量測試盒(批號C035-2-1)購自南京建成生物工程研究所有限公司；山羊抗兔IgG H&L (HRP)(貨號ab205718)、山羊抗小鼠IgG H&L (HRP)(貨號ab205719)購自英國Abcam公司；β-actin抗體(批號100166-MM10)購自北京義翹神州科技股份有限公司。

1.3 儀器 酶標儀、蛋白轉膜儀(美國Bio-Rad公司)；顯微鏡(日本尼康公司)；高速冷凍離心機(美國賽默飛世爾科技公司)；微量分光光度計(杭州奧盛儀器有限公司)；電泳儀(北京六一生物科技有限公司)；凝膠成像系統(上海天能科技有限公司)；實時定量PCR儀(美國ABI公司)。

2 方法

2.1 動物造模、分組與給藥 大鼠適應性飼養1周后，隨機分為5組，即空白組、模型組、纈沙坦組(8.5 mg/kg)及益腎化濕顆粒低、高劑量組(3.125、6.25 g/kg)，每組12只，均行左腎切除術，7 d后，除空白組外，其余4組大鼠均經尾靜脈單次注射2 mg/kg Thy-1抗體，建立不可逆性MsPGN大鼠模型，空白組尾靜脈單次注射等體積生理鹽水。造模完成后，各給藥組灌胃給予相應劑量藥物，空白組和模型組灌胃給予等體積生理鹽水，連續6周。

2.2 樣本采集 于第7、42天灌胃結束后，隨機各取6只大鼠，使用代謝鼠籠收集24 h尿液，4 ℃、1 500 r/min離心5 min，取上清液單獨分裝，保存于-80 ℃冰箱；于第8、43天，將大鼠固定于操作臺，麻醉后開腹，經腹主動脈取血4 mL，4 ℃、3 000 r/min離心10 min，取上清液(即血清)單獨分裝，保存于-80 ℃冰箱；大鼠取血完畢后處死，完整摘取右側腎臟組織，一部分固定于4%多聚甲醛，另一部分液氮速凍后轉移至-80 ℃冰箱保存。

2.3 24 h尿蛋白定量檢測 采用尿蛋白定量測試盒檢測24 h尿蛋白水平。

2.4 血清肌酐、尿素氮水平檢測 使用全自動生化分析儀檢測血清肌酐、尿素氮水平。

2.5 腎組織病理變化觀察 取于第8、43天固定的腎組織樣本，經乙醇脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋，切成4 μm薄片，分別進行HE、Masson染色，顯微鏡下觀察并拍照，并對病理病變進行腎小球系膜細胞及基質增生程度、腎間質纖維化程度分級進行量化評分[6-7]。

2.6 Western blot法檢測大鼠腎組織PCNA、Akt、p-Akt蛋白表達 取適量于第43天冷凍保存的腎組織，裂解后提取總蛋白，經電泳、轉膜后，使用脫脂牛奶封閉1 h，加入一抗PCNA(1∶500)、Akt(1∶500)、p-Akt (Thr308)(1∶500)、β-actin(1∶1 000)4 ℃孵育16 h，洗膜后加入二抗孵育2 h，洗膜后顯色定影，采用Image J軟件進行分析，以β-actin為內參，計算目的蛋白相對表達。

2.7 RT-qPCR法檢測大鼠腎組織PCNA、AktmRNA表達 取適量于第43天冷凍保存的腎組織，提取總RNA并反轉錄為cDNA，然后進行RT-qPCR分析，反應條件為95 ℃預變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火60 s，共循環40次。引物序列見表1。

表1 引物序列

3 結果

3.1 大鼠一般情況 空白組大鼠反應較靈敏，精神狀態佳，進食正常；其余各組造模后精神不振，進食量減少。連續給藥治療6周后，給藥組大鼠精神狀態及進食量優于模型組，各給藥組間大鼠精神狀態及進食量無明顯差異。第43天對各組大鼠體質量進行記錄，與空白組比較，模型組大鼠體質量無明顯變化(P>0.05)；與模型組比較，益腎化濕顆粒各劑量組大鼠體質量增加(P<0.05)，纈沙坦組大鼠體質量增加，但差異無統計學意義(P>0.05)；各給藥組間體質量差異無明顯變化(P>0.05)，見表2。

表2 益腎化濕顆粒對大鼠體質量的影響

3.2 益腎化濕顆粒對MsPGN腎炎大鼠24 h尿蛋白定量的影響 第7天，各組大鼠24 h尿蛋白水平比較無明顯差異(P>0.05)。第42天，與空白組比較，模型組24 h尿蛋白水平升高(P<0.05)；與模型組比較，益腎化濕顆粒各劑量組及纈沙坦組24 h尿蛋白水平降低(P<0.05)；各給藥組比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表3。

表3 益腎化濕顆粒對大鼠24 h尿蛋白定量的影響

3.3 益腎化濕顆粒對MsPGN腎炎大鼠腎功能的影響 第8天，與空白組比較，模型組大鼠血清肌酐水平升高(P<0.01)，尿素氮水平升高，但差異無統計學意義(P>0.05)；與模型組比較，益腎化濕顆粒各劑量組尿素氮水平降低(P<0.05)，血清肌酐水平降低，但差異無統計學意義(P>0.05)。第43天，與空白組比較，模型組血清肌酐、尿素氮水平均升高(P<0.05)；與模型組比較，各給藥組血清肌酐、尿素氮水平均降低(P<0.05)；各給藥組比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表4。

表4 益腎化濕顆粒對大鼠腎功能的影響

3.4 益腎化濕顆粒對MsPGN腎炎大鼠腎組織病理變化的影響 第8天，空白組大鼠腎小球結構基本正常，僅出現極其輕微的系膜細胞增生以及腎間質纖維化，未觀察到毛細血管腔受擠壓的情況；與空白組比較，模型組大鼠腎組織系膜細胞與系膜基質呈現彌漫性增生，毛細血管管腔部分受到擠壓，出現輕度狹窄，提示Thy-1型腎炎大鼠模型制備成功。與空白組比較，模型組大鼠腎小球系膜細胞及基質增生程度評分、腎間質纖維化評分均升高(P<0.05)；各給藥組與模型組比較2項評分均無明顯變化(P>0.05)。第43天，模型組大鼠腎組織系膜細胞、基質增生、腎間質纖維化較空白組嚴重，2項評分均高于空白組(P<0.05)；各給藥組大鼠腎組織系膜細胞增生及細胞外基質沉積、腎間質纖維化程度較模型組改善，2項評分均低于模型組(P<0.05)；各給藥組各評分比較差異無統計學意義(P>0.05)，見圖1、表5。

表5 益腎化濕顆粒對大鼠腎組織病理變化的影響(分，

3.5 益腎化濕顆粒對MsPGN腎炎大鼠腎組織PCNA、Akt、p-Akt蛋白表達的影響 與空白組比較，模型組大鼠腎組織PCNA、p-Akt蛋白表達升高(P<0.05)；與模型組比較，益腎化濕高劑量組和纈沙坦組大鼠腎組織PCNA、p-Akt蛋白表達降低(P<0.05)；各組大鼠腎組織Akt蛋白表達比較差異無統計學意義(P>0.05)，見圖2～3。

3.6 益腎化濕顆粒對MsPGN腎炎大鼠腎組織PCNA、AktmRNA表達的影響 與空白組比較，模型組大鼠腎組織PCNAmRNA表達升高(P<0.05)，AktmRNA表達升高，但差異無統計學意義(P>0.05)；與模型組比較，各給藥組大鼠腎組織PCNA、AktmRNA表達降低(P<0.05)；各給藥組比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表6。

表6 益腎化濕顆粒對MsPGN腎炎大鼠腎組織PCNA、Akt mRNA表達的影響

4 討論

目前MsPGN治療藥物主要包括血管緊張素轉化酶抑制劑或血管緊張素Ⅱ受體阻滯劑、糖皮質激素、免疫抑制劑等[8]。根據該疾病本虛標實之證[9-10]，多數醫家主張使用益氣滋腎、清利濕熱等方醫治[11]。益腎化濕顆粒是以黃芪、人參為君藥，黃芪等為臣藥的16味中藥組方[12]，具有升陽補脾、益腎化濕功效，用于脾虛濕盛證所致蛋白尿等，對癥MsPGN。本研究結果顯示，益腎化濕顆粒可增加大鼠體質量，降低24 h尿蛋白水平，改善腎功能，提示對MsPGN有治療作用。同時，病理結果表明，益腎化濕顆粒能減輕腎小球系膜細胞增生及基質增多，提示其可減輕腎臟病理損傷。

PCNA為DNA聚合酶δ的輔助蛋白[13]，是評價細胞增殖的常用指標之一[14]。有研究證實，在大鼠抗Thy-1腎炎模型造模后第1天，腎小球系膜細胞內PCNA表達上調，提示PCNA能較早反映腎小球系膜細胞的增殖狀況[15]。本研究證明，益腎化濕顆?？山档蚉CNA蛋白和mRNA表達，提示其可能通過抑制PCNA表達，減少處于增殖狀態的腎小球系膜細胞，延緩MsPGN進展。

PI3K/Akt信號通路在腎小球系膜細胞增殖和細胞外基質沉積過程中發揮了重要作用[16-17]。有研究表明，通過抑制該信號通路可抑制高糖誘導的腎小球系膜細胞增殖[18]。本研究發現，各組間Akt mRNA和蛋白表達比較差異無統計學意義，益腎化濕顆粒高劑量組p-Akt蛋白表達低于模型組，這可能是由于Akt被磷酸化修飾為p-Akt后具有生物活性[19]，有研究顯示，p-Akt可參與抗Thy-1腎炎模型中系膜增生的啟動和進展[20]，與本研究結果一致。

綜上所述，益腎化濕顆粒能改善MsPGN大鼠蛋白尿、腎功能及腎組織病理損傷，從而保護腎臟功能，延緩腎臟病變，其機制可能與抑制PCNA、p-Akt表達有關。本研究為益腎化濕顆粒治療MsPGN的相關機制提供了一定的實驗基礎。