左旋延胡索乙素對快速眼動睡眠剝奪大鼠學習記憶和睡眠活動節律的影響

王艷艷， 卞宏生， 李海妮， 陳芋霏， 李玟玟， 李廷利， 黃莉莉

(黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040)

現代社會越來越多的人受到睡眠障礙的困擾，經歷著不同程度的睡眠剝奪[1]。據調查，在我國30～79歲人群中，患有睡眠障礙的高達23.1%[2]。睡眠障礙會影響重要的大腦功能，如警覺性、認知功能，亦可增加負面情緒[3-5]。有研究表明，快速眼動睡眠剝奪可影響記憶的鞏固，導致海馬依賴性學習和記憶障礙等[6-7]。睡眠具有晝夜節律，與飲食、情緒、代謝、認知、行為等多項生理指標有關聯，對于維持機體穩態和生理活動的正常具有重要意義[8]。

延胡索為罌粟科植物延胡索CorydalisyanhusuoW.T.Wang的干燥塊莖，具有活血化瘀、行氣止痛等功效，李時珍記載延胡索“專治一身上下諸痛，用之中的，妙不可言”。延胡索鎮痛的主要活性物質為生物堿，其中以延胡索乙素作用最強[9-10]，鎮痛效果被稱為中藥中的嗎啡[11]。現代研究發現，延胡索乙素除具有鎮痛鎮靜作用外，還有抗心律失常、改善血脂、保護缺血再灌注組織等作用[12-13]，并且該成分為消旋體，其左旋體活性較強，但它是否干預快速眼動睡眠剝奪所致的認知障礙和睡眠活動覺醒節律尚不清楚。因此，本研究通過六角迷宮實驗和動物監測系統，考察左旋延胡索乙素對快速眼動睡眠剝奪大鼠學習記憶功能、睡眠覺醒節律和能量代謝的影響。

1 材料

1.1 動物 SPF級SD大鼠，雄性，體質量(240±20)g，由黑龍江中醫藥大學GLP實驗室提供，實驗動物生產許可證號SCXK(黑) 2018-007。飼養環境為溫度(22±2)℃，相對濕度(55±15)%，12 h/12 h明暗交替。經黑龍江中醫藥大學實驗動物管理和使用委員會審核，實驗動物倫理審查批準編號DWLL20191228001。

1.2 試劑與藥物 左旋延胡索乙素(純度≥98%，上海融禾醫藥科技發展有限公司，批號170926)；地西泮片(山東信誼制藥有限公司，批號191006)。氯化鈉注射液(哈爾濱三聯藥業股份有限公司，批號200907D06)；2% DMSO(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號D103273)；γ-氨基丁酸(GABA)酶聯免疫檢測試劑盒(貨號H168-1-2)、谷氨酸測試盒(貨號A074-1-1)均購自南京建成生物工程研究所。

1.3 儀器 睡眠剝奪箱(自制)；六角迷宮箱(俄羅斯阿穆爾國立醫學院)；實驗動物監測系統(型號CLAMS，美國Columbus公司)；動物行為學采集與分析系統(型號BL420F，成都泰盟軟件有限公司)。

2 方法

2.1 動物分組及給藥 32只大鼠隨機分為空白組、模型組、陽性藥組及左旋延胡索乙素高、低劑量組，每組8只。左旋延胡索乙素各組分別灌胃給予15、5 mg/kg左旋延胡索乙素溶液，空白組和模型組灌胃給予等體積生理鹽水，陽性藥組給予1 mg/kg地西泮溶液，每天19：00給藥1次，連續7 d。

2.2 建立睡眠剝奪模型 采用多平臺水環境法建立大鼠睡眠剝奪模型。給予藥物或生理鹽水5 d后，將動物放入睡眠剝奪箱(90 cm×70 cm×50 cm，內有12個平臺，高8.0 cm，直徑6.3 cm，平臺之間間隔15 cm，平臺周邊注滿水，水面距平臺面約1.0 cm，水溫保持在25 ℃左右)內進行快速眼動睡眠剝奪，共24 h。

2.3 六角迷宮實驗 六角迷宮箱，由俄羅斯阿穆爾國立醫學院格里格力耶夫教授發明，箱體為六角形，周壁帶有6個可關閉的門，底面鋪有可通電的銅柵。訓練時，以鈴聲為刺激，足底電擊為非條件刺激。實驗通過攝像系統及計算機記錄大鼠的尋找時間、尋找頻率和認知率，綜合以上指標，可考察動物的探究積極性、興奮性、認知能力[14]。本實驗各組動物于給藥后第3天開始學習記憶訓練，訓練時間為3 d，于第5天進行24 h的快速眼動睡眠剝奪，剝奪后的動物休息24 h后，于給藥第7天放入六角迷宮箱中進行學習記憶的測試，并記錄各指標。

2.4 能量代謝、自主活動、睡眠時間和睡眠活動節律檢測 分別將睡眠剝奪后的各組大鼠置于實驗動物監測系統的代謝籠內，在定時光照(照明時間為7：00～19：00，熄燈時間為19：00～次日7：00)的條件下，采用CLAMS系統對大鼠進行24 h的監測，該系統還持續監測大鼠的進食活動[15]。通過撞擊紅外光束，判斷大鼠活動次數[12](在系統監測前設置參數，采集率為1 samples/60 s，即系統每1 min自動收集1次樣本數據，每天有1 440個采集點)，以活動次數為0作為依據，計算大鼠24 h的睡眠時間，由于19:00～20:00為灌胃給藥時間，自主活動和睡眠時間影響較大，故此時間段數據不作處理，實驗結果計算總時間為23 h(20:00～次日19:00)。

2.5 神經遞質水平檢測 行為學實驗完成后，大鼠腹腔注射10%水合氯醛(0.4 mL/100 g)進行麻醉，頸總動脈取血，3 000 r/min離心20 min，取上清液。按試劑盒說明書操作方法進行檢測，并計算大鼠血清中Glu和GABA水平。

3 結果

3.1 左旋延胡索乙素對睡眠剝奪大鼠學習記憶的影響 如表1所示，與空白組比較，模型組大鼠尋找時間、錯誤次數增加(P<0.05)，認知率降低；與模型組比較，左旋延胡索乙素高劑量組大鼠認知率提高，尋找時間和錯誤次數減少 (P<0.01)。

表1 左旋延胡索乙素對睡眠剝奪大鼠學習記憶的影響

3.2 左旋延胡索乙素對睡眠剝奪大鼠自主活動的影響 如表2所示，與空白組比較，模型組大鼠白天、夜晚及全天平均活動次數均減少(P<0.01)；與模型組比較，陽性藥組和左旋延胡索乙素各劑量組大鼠白天、夜晚及全天活動次數均減少(P<0.01)。

表2 左旋延胡索乙素對睡眠剝奪大鼠自主活動的影響

3.3 左旋延胡索乙素對睡眠剝奪大鼠睡眠時間的影響 如表3所示，與空白組比較，模型組大鼠白天、夜晚及全天睡眠時間均增加，但無統計學差異(P>0.05)；與模型組比較，陽性藥組大鼠白天、夜晚及全天睡眠時間均增加，其中夜晚睡眠時間具有統計學差異(P<0.05)，左旋延胡索乙素高劑量組夜晚及全天睡眠時間增加，但無統計學差異(P>0.05)，左旋延胡索乙素低劑量組夜晚和全天睡眠時間均增加(P<0.05，P<0.01)。

表3 左旋延胡索乙素對睡眠剝奪大鼠睡眠時間的影響

3.4 左旋延胡索乙素對睡眠剝奪大鼠睡眠活動節律的影響 通過降噪處理，對各組大鼠給藥后每小時的睡眠時間進行分析，結果如圖1所示，與空白組比較，模型大鼠在21～22時、2～3時、5～6時、15～18時睡眠時間增加(P<0.05，P<0.01)；與模型組比較，陽性藥組在22～24時、6～7時、7～8時、13～15時睡眠時間增加(P<0.05，P<0.01)，左旋延胡索乙素高劑量組在20～21時、23～24時睡眠時間增加(P<0.05，P<0.01)，16～18時睡眠時間減少(P<0.05)，左旋延胡索乙素低劑量組在22～1時、11～15時睡眠時間增加(P<0.05，P<0.01)。

3.5 左旋延胡索乙素對睡眠剝奪大鼠睡眠活動節律的影響 如圖2所示，與陽性藥地西泮比較，左旋延胡索乙素作用特點為給藥后睡眠發生次數增加，睡眠時間延長，藥效發揮迅速，但其藥效維持時間相對較短，其中高劑量給藥12 h后大鼠活動力恢復。

3.6 左旋延胡索乙素對睡眠剝奪大鼠神經遞質水平的影響 如表4所示，與空白組比較，模型組大鼠海馬中Glu和GABA水平升高(P<0.01)；與模型組比較，陽性藥組和左旋延胡索乙素高劑量組大鼠海馬中Glu和GABA水平均降低(P<0.05，P<0.01)。

表4 左旋延胡索乙素對睡眠剝奪大鼠神經遞質水平的影響

3.7 左旋延胡索乙素對睡眠剝奪大鼠能量代謝的影響 如表5所示，與空白組比較，模型組大鼠白天產熱量、攝食量和飲水量均增加，夜晚產熱量和飲水量則減少；與模型組比較，陽性藥組和左旋延胡索乙素各劑量組大鼠白天攝食量減少(P<0.01)。

表5 左旋延胡索乙素對睡眠剝奪大鼠能量代謝的影響

3.8 大鼠睡眠時間與能量代謝的相關性分析 如表6所示，大鼠白天睡眠時間與產熱量呈負相關(P<0.01)，夜晚睡眠時間與白天產熱量和攝食量均呈負相關(P<0.01)，上述結果提示能量代謝指標如產熱量、飲水量等與睡眠時間具有一定相關性。

表6 大鼠睡眠時間與能量代謝的相關分析

4 討論

有研究顯示，正常睡眠能夠促進記憶的鞏固，而睡眠障礙則會導致認知能力下降[16]。王純等[1]發現慢性睡眠剝奪可加重9月齡3xTg-AD小鼠的識別記憶能力、工作記憶和條件恐懼記憶能力損傷。另有報道稱左旋延胡索乙素能抑制冰毒誘導的小鼠空間記憶損傷[17]。本實驗結果顯示，快速眼動睡眠剝奪后，模型組大鼠尋找時間延長，尋找頻率和認知率降低，表明睡眠剝奪后大鼠出現學習記憶障礙。左旋延胡索乙素干預后，高劑量組大鼠認知率提高，錯誤次數減少，提示該成分可改善快速眼動睡眠剝奪后大鼠的學習記憶能力。

徐波等[18]采用對氯苯丙氨酸腹腔注射疊加多平臺水環境剝奪可造成大鼠睡眠節律紊亂，并考察了安寐丹對不同周期睡眠剝奪模型大鼠晝夜節律、學習記憶及食欲素的影響。本實驗結果顯示，快速眼動睡眠剝奪大鼠的睡眠時間增加，自主活動次數減少，但睡眠活動節律未改變，提示睡眠剝奪24 h未改變大鼠的晝夜節律。給藥后，陽性藥地西泮組大鼠各時間段睡眠時間均有延長，活動力降低，且維持時間長。鎮靜催眠藥物如地西泮等具有中樞神經系統抑制作用，其副反應為易產生依賴性、戒斷癥狀和宿醉反應。宿醉反應作為化學類助眠藥物的常見后遺效應，表現為服藥次晨出現頭暈、嗜睡、精細運動不協調等[19]。與陽性藥地西泮組比較，左旋延胡索乙素作用特點為給藥后睡眠剝奪大鼠睡眠發生次數增加，睡眠時間延長，且藥效發揮迅速，但維持時間相對較短，大鼠活動力恢復較快，無宿醉現象，且未呈現劑量依賴性。本實驗在夜晚給藥時，發現大鼠夜晚睡眠時間延長，前期研究發現，當白天給藥時，左旋延胡索乙素可增加大鼠的白天睡眠時間。因此，推測延胡索可能具有調節睡眠剝奪大鼠睡眠活動節律的作用。

清醒狀態下測得的代謝率為靜息代謝率，估算了在日常生活中大多數清醒狀態下的最低能耗。睡眠時測得的代謝率為睡眠代謝率，因為睡眠時測得的能耗值明顯減少了意識活動帶來的額外能耗部分，測得的結果具有更高重復性和精確性[20-21]。本實驗進行了快速眼動大鼠睡眠時間與能量代謝相關指標的相關分析。結果顯示，大鼠白天和夜晚睡眠時間與白天產熱量呈負相關，提示睡眠時間延長，產熱量減少，大鼠在睡眠狀態下意識活動減少時能耗降低。

綜上所述，左旋延胡索乙素可提高快速眼動睡眠剝奪組大鼠的認知能力，減少自主活動，延長睡眠時間，且無宿醉現象，是一個極具潛力的催眠劑。然而該成分作為鎮靜催眠藥物的臨床應用頻率較低，近年來實驗研究和臨床數據均較少，故本研究可為其廣泛應用提供理論依據。