川烏中1個新的烏頭堿類二萜生物堿

馬 莉， 李新亮， 史丹丹， 冷雪嬌， 李存玉,2， 鄭云楓,2， 彭國平,2*

(1.南京中醫藥大學藥學院，江蘇 南京 210023；2.江蘇省中藥資源產業化過程協同創新中心，江蘇 南京 210023)

川烏始載于《神農本草經》，為毛莨科植物烏頭AconitumcarmichaeliDebx.的干燥母根，其味辛、苦，性熱，有大毒，具有祛風除濕、溫經止痛的功效[1]，其化學成分主要為烏頭堿類二萜生物堿，也是主要藥效物質基礎。現代藥理研究表明，烏頭堿型生物堿酯鍵的數量決定化合物毒性強弱，雙酯型毒性最強，在生川烏中含量最高[2-6]，主要分布在循環系統，具有很強的抗炎、消腫及鎮痛作用，但易導致各種心律失常的心臟毒性，從而限制了對單酯型及醇胺型烏頭堿類二萜生物堿的開發應用。為了降低川烏中烏頭堿類雙酯型生物堿的毒性，探索相關藥物應用的可能性，本實驗通過堿水解讓酯鍵水解，分離得到3種烏頭堿類二萜生物堿，其中1個為新化合物。

1 材料

MicroTOF-Q質譜儀、ASR-500核磁共振儀，購自德國Bruker公司；Waters e2695高效液相色譜儀，購自美國Waters公司；Thermo Nicolet IR100紅外光譜儀，購自美國Thermo公司；制備色譜柱Hedera ODS-2 C18(10 mm×250 mm，5 μm)；ELSD 6000蒸發光散射檢測器，購自美國Auter公司；R-114旋轉蒸發儀，購自瑞士Buchi公司；MS-105DU電子天平，購自瑞士梅特勒-托利多公司；LGJ18-D真空冷凍干燥機，購自上海舜制儀器制造有限公司。

氘代吡啶，購自上海凜恩科技發展有限公司；尼奧靈(批號JBZ-0866，純度大于98.0%)，購自南京金益柏生物技術有限公司；AB-8大孔樹脂，購自上海麥克林生化科技有限公司；三氟乙酸、乙腈、甲醇為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

川烏購自亳州，經南京中醫藥大學嚴輝教授鑒定為為毛莨科植物烏頭AconitumcarmichaeliDebx.的干燥母根。

2 提取與分離

取鮮川烏切片15 kg，加氫氧化鈣250 g，置于煎煮鍋中加熱煎煮2次，第1次加水40 L，加熱煎煮1 h，濾出藥液；第2次加水35 L，加熱煎煮30 min，濾出藥液，合并2次濾液，靜置6 h，冷卻至50 ℃，上清液過濾。取2.5 L已預處理AB-8大孔樹脂，裝到層析柱中，水洗去除氣泡，加入藥液，待其流盡后用去離子水25 L洗脫去除無機物，依次用15%乙醇、0.1%甲酸、含0.1%甲酸的15%乙醇各10 L洗脫，收集洗脫液，減壓回收溶劑，冷凍干燥，得總烏頭原堿，用80%乙醇溶解，經制備液相[色譜條件為流動相乙腈(A)-0.2%三氟乙酸(B)，梯度洗脫(0～50 min，11% ～21%A)；體積流量5.0 mL/min；柱溫30 ℃。ELSD檢測器氣體體積流量2.8 L/min；漂移管溫度110 ℃]，收集液回收溶劑至少量，冷凍干燥，得化合物1(75 mg)、2(20 mg)、3(15 mg)(保留時間分別為23.6、17.8、30.8 min)。

3 結構鑒定

化合物1：白色無定形粉末，改良碘化鉍鉀試劑顯色呈陽性；[α]20D=4°(c=0.1，MeOH)，紫外光譜(MeOH)下沒有吸收，提示不具有α, β-不飽和系統。IR光譜顯示羥基(3 527 cm-1)的特征吸收。高分辨質譜檢測可見準分子離子峰m/z:438.282 9 [M+H]+(計算值為438.285 5)，確定分子式為C24H39NO6，不飽和度為6。此外，在質譜圖中還可觀察到m/z:420.272 5[M+H-H2O]+、388.246 6[M+H-CH3OH-H2O]+、356.221 0[M+H-2CH3OH-H2O]+等碎片離子峰，符合烏頭堿質譜裂解規律[7-11]。

在1H-NMR譜中，δH4.17 (1H, s)、4.45 (1H, d)分別給出2個可能為連氧碳上的質子信號，δH3.27 (3H, s)、 3.30 (3H, s)、3.46 (3H, s)分別給出3個單峰甲基信號，δH1.30 (3H，t，J=14.3 Hz)為氮乙基中甲基(N-CH2-CH3)質子信號；在13C-NMR譜中，給出24個碳信號，其中δC58.8、55.7、57.9處分別給出可能為3個連氧的甲基信號，δC70.8、74.1、75.2處分別給出3個連羥基信號，具體見表1。由HMBC譜可知，H-1(δ4.17)與C-3(δ28.2)、C-10(δ44.1)相關，H-5(δ2.26)與C-18(δ79.0)、C-17(δ64.2)、C-19(δ57.8)、C-7(δ53.8)、C-10(δ44.1)、C-4(δ38.2)、C-11(δ50.3)相關，H-6(δ4.47)與C-4(δ38.2)、C-8(δ74.1)、C-17(δ64.2)相關，H-7(δ2.48)與C-6(δ82.4)、C-8(δ74.1)、C-9(δ48.0)、C-11(δ50.3)、C-15(δ41.9)、C-17(δ64.2)相關，H-9(δ2.38)與C-8(δ74.1)、C-13(δ41.1)相關，H-15(δ2.86, 2.50)與C-7(δ53.8)、C-13(δ41.1)、C-16(δ82.7)相關，H-16(δ3.54)與C-14(δ75.2)、C-23(δ55.7)、C-12(δ30.8)相關，H-17(δ3.55)與C-6(δ82.4)、C-8(δ74.1)、C-19(δ57.8)、C-11(δ50.3)、C-5(δ43.4)相關，H-18(δ3.48, 3.52)與C-3(δ28.2)、C-4(δ38.2)、C-5(δ43.4)、C-19(δ57.8)相關，H-19(δ3.37, 3.24)與C-3(δ28.2)、C-5(δ43.4)、C-7(δ53.8)、C-8(δ74.1)相關，18-OCH3(δ3.27)與C-18(δ79.0)相關，16-OCH3(δ3.30)與C-16(δ82.7)相關，6-OCH3(δ3.46)與C-6(δ82.4)相關，δH1.30(3H)與氮上亞甲基碳(N-CH2-CH3)相關，平面結構見圖1，再以HMBC、H-H COSY譜進行驗證，見圖2。

表1 化合物11H-NMR、13C-NMR數據

查閱文獻[12-15]可知，愛可寧平面結構與尼奧寧相同，兩者1H-NMR(C5D5N，500 MHz)、13C-NMR(C5D5N，125 MHz)數據見表2，可知存在明顯差異，故推測化合物1可能為尼奧寧的手性異構體，與后者結構區別為1-位羥基的手性差異。

表2 愛可寧、尼奧寧1H-NMR、13C-NMR數據

從分子模型分析，由于1-位羥基處于低能態的平伏鍵(e)鍵，此時1位氫處于直立鍵，成單峰，A環發生從船式構型轉變成椅式構型的改變，從而使A環以及與A環連接碳上的質子位移發生變化，此時1位氫處于直立鍵，仍然成單峰，見圖3。

由此可知，A環質子H-1、H-2、H-3，A環鄰碳上質子H-6、H-10、H-17、H-18、H-19，以及空間阻礙的相關質子H-20、H-21均明顯發生位移，特別是H-1明顯向低場移動(δH4.17～4.45)，H-17明顯向高場移動(δH3.55～2.93)；H-18中2個氫化學位移相近，使dd峰重疊成δH3.50位置的t峰，而立體異構化后差異變大，其中1個氫明顯向低場移動至δH3.69，另1個為δH3.42，各呈d峰；H-19中2個氫有1個從δH3.37移至δH2.84，另1個從δH3.24移至δH2.39，即均明顯向高場移動，兩者之間差值增大；N乙基上的質子非常明顯，亞甲基向低場移動，而甲基從δH1.30移動至δH1.01，即明顯向高場移動。因此，H-1、H-17、H-18中2個氫、H-19中2個氫、N乙基上的甲基質子(H-21)可作為A環立體異構體鑒定的特征，見表3。

表3 1-羥基立體異構的氫譜特征

化合物1為烏頭堿結構轉化而來，從1-甲氧基的水解反應機理來分析，其1-位手性在 -OH進攻時從手性另一側進攻，會發生手性反轉的變化。另外，NOESY譜可進一步確證立體構型，其中H-1和H-12、H-6和H-9/H-18、H-16和H-13/H-7、H-17和H-12/H-3、H-18和H-5/H-21、N-CH2-CH3和H-18/18-OCH3之間有NOE效應。

采用多頻率位移激發雙梯度自旋回波1D NOESY對尼奧靈和化合物1的構型差別進行辨認[16-18]，發現兩者H-17與H-1的空間取向不同，故通過選擇激發H-17來觀測H-1的NOE實驗很容易鑒別這2種差向異構體。化合物1的H-1與H-17是同向，有NOE效應，而尼奧靈兩者是反向，無NOE效應，故前者是后者1-位羥基的手性異構體，將其命名為愛可寧，為首個鑒定出的烏頭堿類1-α-OH化合物，見圖4。

化合物2：白色粉末，ESI-MSm/z:358[M+H]+，分子式C22H31NO3。1H-NMR(C5D5N，500 MHz)δ：5.51、5.48(brs，1H，H-17)，4.68(s，1H，H-15)，1.21(t,J=14.3 Hz，3H，-NCH2CH3)，0.68(s，3H，18-CH3)；13C-NMR(C5D5N，125 MHz)δ：69.3(C-1)，31.7(C-2)，37.5(C-3)，34.8(C-4)，48.9(C-5)，22.8(C-6)，44.1(C-7)，49.1(C-8)，37.0(C-9)，52.9(C-10)，38.7(C-11)，209.0(C-12)，54.5(C-13)，31.1(C-14)，76.7(C-15)，151.7(C-16)，110.9(C-17)，25.5(C-18)，57.0(C-19)，65.4(C-20)，52.5(C-21)，11.7(C-22)。以上數據與文獻[19]報道一致，故鑒定為宋果靈。

化合物3：白色粉末，ESI-MSm/z:422[M+H]+，分子式C24H39NO5。1H-NMR(C5D5N，500 MHz)δ：3.27，3.26，3.20(s，3H，-OCH3×3)，1.28(t，J=12.5 Hz，3H，-NCH2CH3)；13C-NMR(C5D5N，125 MHz)δ：83.0(C-1)，25.2(C-2)，29.7(C-3)，38.1(C-4)，34.5(C-5)，22.6(C-6)，41.4(C-7)，73.8(C-8)，47.0(C-9)，46.4(C-10)，49.3(C-11)，28.2(C-12)，45.1(C-13)，75.1(C-14)，40.6(C-15)，82.7(C-16)，62.5(C-17)，78.4(C-18)，51.4(C-19)，49.4(C-20)，11.5(C-21)，55.4(C-22)，55.8(C-23)，58.9(C-24)。以上數據與文獻[20]報道一致，故鑒定為塔拉烏頭胺。