黃精多指標成分近紅外光譜快速定量分析模型建立

呂 悅， 吳杭莎， 韋飛揚， 葛衛紅*， 杜偉鋒,2,3*， 李昌煜， 張葉峰

(1.浙江中醫藥大學藥學院，浙江 杭州 310053；2.浙江中醫藥大學中藥炮制技術研究中心，浙江 杭州 311401；3.浙江中醫藥大學中藥飲片有限公司，浙江 杭州 311400；4.浙江中醫藥大學中醫藥科學院，浙江 杭州 310053；5.寧波市中藥飲片有限公司，浙江 寧波 315000)

黃精是我國應用歷史悠久的傳統名貴滋補中藥[1]。黃精含有多糖、皂苷、黃酮、生物堿、木脂素[2-4]類化合物，其中多糖、皂苷類成分含量較高，為發揮藥效作用的主要成分，有抗疲勞、抗氧化、降血糖血脂等作用[5-6]，可作為體現黃精飲片質量的指標。5-羥甲基糠醛[7]為黃精炮制后產生的化合物且含量變化巨大，其使用安全風險和治療保健功效存在爭議。因不同產地的黃精配方顆粒中5-羥甲基糠醛含量差異較大也將其列為主要成分[8]。2020年版《中國藥典》對黃精含量測定項下的指標為多糖，而黃精炮制前后多糖、皂苷、5-羥甲基糠醛含量都發生變化[9-11]。目前，黃精飲片常用色譜法開展質量評價，包括薄層色譜、高效液相色譜法、指紋圖譜和液質聯用法等手段[12-13]。基于綠色化學可持續發展理念，創新中藥提取分析方法，構建綠色中藥質量評價體系，建立一種快速無損，簡便可靠的黃精飲片多指標定量方法尤為重要。

近紅外光譜分析技術是通過照射紅外光得到樣品吸收光譜，反應樣品中分子振動能級躍遷的信息，目前已廣泛應用于食品、中藥材真偽鑒別、產地鑒別及質量定量分析方面[14-15]，是一種有效的質量控制和鑒別技術，有檢測快速、操作簡便、高靈敏度等特點，且在多種藥材有所應用，如延胡索、片姜黃、薏苡仁[16-18]等。在此基礎上，本研究首次利用近紅外光譜技術進行黃精飲片的質量控制，通過收集大量不同產地黃精飲片，以多糖、皂苷和5-羥甲基糠醛含量為黃精活性成分代表，采集所有樣品的近紅外光譜圖，結合偏最小二乘法(PLS)建立黃精飲片多指標近紅外定量模型，以期實現黃精飲片質量快速評價及控制。

1 材料

Antaris Ⅱ型傅立葉變換近紅外光譜儀、TQ Analyst 8.3.125分析軟件、U3000高效液相色譜儀(美國ThermoFisher公司)；UV-2450紫外-可見分光光度計(日本島津公司)；KQ-500DB型數控超聲波清洗機(昆山市超聲儀器有限公司)；NT-xs105電子分析天平(0.01 mg，瑞士 Mettler Toledo公司)；DFD-700電熱恒溫水浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司)；MIL-SYN型超純水儀(美國Milipore公司)。

無水葡萄糖標準品(純度99%，批號G6172-500)、人參皂苷Rb1(純度99%，批號110704-202129)均購自中國食品藥品檢定研究院；5-羥甲基糠醛標準品(純度>98%，批號B21832)購自上海源葉生物有限公司；乙醇、二氯甲烷均為色譜純，甲醇為分析純，水為超純水。

138批黃精分別購自浙江中醫藥大學飲片有限公司、安徽亳州千草國藥、山東博康藥業、河北春開制藥等16家國內中藥飲片有限公司。

2 方法與結果

2.1 多糖含量測定 按2020年版《中國藥典》中黃精含量測定項下的方法測定。以多糖質量濃度為橫坐標(X)，吸光度為縱坐標(A)，得到回歸方程A=20.682X+0.011 9(R2=0.998 9)，在0.003 1～0.023 2 mg/mL范圍內線性關系良好，精密度、重復性、穩定性試驗RSD分別為0.43%、1.07%、0.36%；平均加樣回收率100.87%。

2.2 皂苷含量測定

2.2.1 供試品溶液的制備 精密稱取黃精粉末0.5 g置于具塞錐形瓶中，加入80%乙醇25 mL，每個樣品平行3份。60 ℃超聲60 min，重復提取2次，過濾，合并濾液至50 mL量瓶中，用80%乙醇定容。

2.2.2 標準曲線 精密稱取人參皂苷Rb1對照品適量，甲醇溶解，得1.0 mg/mL對照品溶液。分別吸取對照品溶液0.06、0.12、0.18、0.24、0.30、0.36、0.42 mL于試管中揮干，加入0.2 mL 5%香草醛-冰醋酸溶液和0.8 mL高氯酸，搖勻，在60 ℃水浴保溫15 min后，冰浴2 min，加入5 mL冰醋酸溶液，搖勻，靜置5 min[19]。以相應試劑為空白，于568 nm波長測定吸光度。以人參皂苷Rb1質量濃度為橫坐標(X)，吸光度為縱坐標(A)，得到回歸方程A=13.704X-0.015 9(R2=0.995 2)，在0.009 9～0.070 3 mg/mL范圍內線性關系良好。

2.2.3 方法學考察 精密吸取對照品溶液，按“2.2.2”項下方法連續測定6次，RSD為0.78%。取同一批樣品，按“2.2.1”項方法制備供試品溶液，按“2.2.2”項下方法分別于0、5、10、20、40、60 min測定，RSD為1.35%，表明供試品溶液穩定性良好。取同一批樣品，按“2.2.1”項方法平行制備6份供試品溶液，按“2.2.2”項下方法測定，RSD為0.61%，表明方法重復性良好。取已知皂苷含量的黃精樣品粉末6份，每份0.5 g，精密加入人參皂苷Rb1對照品，測定平均加樣回收率為99.83%，RSD為1.12%。

2.2.4 含量測定 精密吸取供試品溶液0.1 mL，按“2.2.2”項下的方法測定，計算皂苷含量。

2.3 5-羥甲基糠醛含量測定

2.3.1 供試品溶液制備 精密稱取樣品1 g于具塞錐形瓶中，精密加入20 mL二氯甲烷，超聲60 min，放冷，補重。精密吸取10 mL，蒸干，殘渣加入甲醇溶解，轉移置5 mL量瓶中，甲醇定容至刻度，過0.22 μm濾膜即得。

2.3.2 對照品溶液制備 精密稱取19.37 mg 5-羥甲基糠醛于10 mL量瓶中，加入甲醇定容至刻度，精密吸取上述溶液置于10 mL量瓶中，加甲醇定容置刻度，搖勻，即得0.193 7 mg/mL對照品溶液。

2.3.3 色譜條件 Agilent ZORBAX-Extend-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相甲醇(A)-水(B)，梯度洗脫(0～16 min，7%A；16～17 min，7%～20%A；17～40 min，20% A)；檢測波長300 nm；柱溫30 ℃；進樣量10 μL；體積流量1 mL/min[20]。色譜圖見圖1，各峰達到基線分離，分離度均大于1.5。

2.3.4 線性關系考察 精密吸取對照品溶液1、2、5、10、15、30 μL測定，以對照品質量濃度為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標(Y)，得回歸方程Y=45 317X+1.179 7(R2=0.999 3)，在0.000 1～0.005 8 μg范圍線性關系良好。

2.3.5 精密度試驗 精密吸取對照品溶液，在“2.3.3”項下方法連續進樣6次，測定峰面積，RSD為0.85%，表明儀器精密度良好。

2.3.6 穩定性試驗 取同一批樣品，在“2.3.1”項方法制備供試品溶液，在“2.3.3”項下方法分別于0、1、2、4、8、12、24 h進樣10 μL，測定峰面積，RSD為0.72%，表明供試品溶液穩定性良好。

2.3.7 重復性試驗 取同一批樣品，在“2.3.1”項方法平行制備6份，按“2.3.3”項下方法進樣分析，測定峰面積，RSD為1.68%，表明方法重復性良好。

2.3.8 加樣回收率試驗 取已知含量黃精粉末6份，每份1 g，精密加入5-羥甲基糠醛對照品在“2.3.1”項方法制備供試品溶液，測定平均加樣回收率為99.12%，RSD%為0.74%。

2.4 近紅外光譜采集 將138批黃精粉碎后過5號篩，取約10 g于石英杯中攤平，以內置背景做參比扣除，采集光譜圖。采樣方式積分漫反射，波數區間3 999～10 001 cm-1，分辨率8.0 cm-1。室溫23～27 ℃，重復掃描3次，取其平均光譜，見圖2。

2.5 校正集與驗證集的劃分 從138批黃精中隨機選取16批作為驗證集，122批作為校正集，含量測定結果見表1。

表1 校正集與驗證集的含量測定結果

2.6 近紅外光譜預處理 定量模型的校正算法有逐步多遠線性回歸法(SMLR)、偏最小二乘法(PLS)、主成分回歸法(PCR)。對于組分復雜的中藥，多選用PLS[21-22]。以相關系數、均方差、預測均方差為考察指標進行考察，其中相關系數越接近1，均方差、預測均方差越接近0，模型預測精密度越好。首先通過多元信號校正(MSC)或標準正則變換(SNV)對由于樣品顆粒和分布不規則引起的偏差進行消除，減少光散射或光程差造成的影響[23]；再通過原始光譜、一階求導(1std)或二階求導(2std)減輕光譜基線漂移；最后用無平滑(NS)、卷積平滑濾波(S-G)或者Norris導數平滑濾波(Nd)處理方法提高信噪比、減小隨機誤差[24]，見表2。由表2可知，當多糖、皂苷、5-羥甲基糠醛分別選擇MSC+1stD+NS、MSC+Spectrum+S-G、MSC+1stD+S-G方法處理時，相關參數最優，因此選用此方法對光譜數據預處理。

表2 不同光譜預處理方法對校正模型的影響

2.7 波段選擇 以性能指數為指標，通過TQ Analyst軟件優化，選擇最適宜分析的光譜波段，見表3，得到多糖、皂苷、5-羥甲基糠醛最優波段分別為5 149.01～4 720.89、5 850.97～5 800.83、4 898.31～4 184.77、9 931.6～8 280.84 cm-1，模型預測精密度良好。

表3 不同光譜范圍的影響

2.8 主因子數選擇 通過PLS建立定量模型時，主因子數的數量會影響定量模型的精密度。主因子數過少可能會導致精密度降低，主因子數過多可能會產生過擬合現象。通過預測殘差平方和以及內部交叉驗證均方根誤差(RMSECV)篩選主因子數，考察主因子數對多糖、皂苷、5-羥甲基糠醛的影響，結果表明最佳主因子數分別為6、9、5時模型的RMSECV最小，模型的準確度最高。

2.9 異常值剔除 經光譜Outliers優化，以馬氏距離作為評價指標，對異常值進行剔除，以保證模型的準確性，見圖3。異常值檢驗表明樣品均符合要求。

2.10 定量模型的建立與驗證 以篩選后的最優預處理方法作為參數評價指標(表4)，建立定量模型，具體模型參數及各個變量實際值與預測值的相關性見圖4～6。

表4 定量模型參數評價指標

將預測集(n=16)樣品光譜輸入定量模型中，得出其預測值，通過預測值與實際值的相對偏差，考察模型的準確度，見表5與圖7。多糖、皂苷、5-羥甲基糠醛含量預測值與實際值的平均相對偏差分別為1.60%、0.87%、0.14%，均小于2%，t檢驗P值分別為0.92、0.84、0.86，均大于0.05，表明驗證集預測值與檢驗值無顯著性差異，模型準確度良好。

表5 驗證集含量預測與結果偏差

2.11 定量模型方法學考察 精密度試驗，在“2.4”項下方法采集近紅外光譜圖6次，導入建立的近紅外定量模型中，預測多糖、皂苷、5-羥甲基糠醛含量，RSD均小于2%，表明該定量模型精密度良好。重復性試驗，取同一批樣品，分成6份，在“2.4”項下方法采集近紅外光譜圖，導入建立的近紅外定量模型中，預測多糖、皂苷、5-羥甲基糠醛含量，RSD均小于2%，表明該定量模型重復性良好。穩定性試驗，取同一批樣品，分別于0、1、2、4、8、12 d，在“2.4”項下方法采集近紅外光譜圖，導入建立的近紅外定量模型中，預測多糖、皂苷、5-羥甲基糠醛含量，RSD均小于2%，表明該定量模型穩定性良好。

3 討論

本研究測定黃精的含量，通過近紅外光譜法結合偏最小二乘法(PLS)建立黃精近紅外多指標定量模型，建立模型的R值均大于0.9，相對偏差均小于2%，模型準確度良好，實現了近紅外光譜技術在黃精飲片中的首次應用以及多糖、皂苷、5-羥甲基糠醛含量的快速測定，為其在炮制全過程質量控制奠定了基礎。