干姜揮發油膠體磨包合工藝優化

沈慶國， 屈玲霞*， 于祥玉， 孫 艷， 趙雪君， 韓學順， 滕延飛 ，關永霞*

(1.魯南厚普制藥有限公司，山東 臨沂 276006；2.魯南制藥集團中藥制藥共性技術國家重點實驗室，山東 臨沂 276006)

干姜系姜科植物姜ZingiberofficinaleRosc.的干燥根莖，主產于四川、貴州等地[1]，其味辛，性熱，歸脾、胃、腎、心、肺經，具有溫中散寒、回陽通脈、溫肺化飲的效[2]，為中醫臨床常用的溫里藥，主要成分為揮發油。

在中藥制劑制備過程中，很多工藝要求揮發油直接噴灑在顆粒上，導致該成分易氧化揮散，并具有刺激性氣味，從而影響制劑穩定性、患者依從性、臨床療效[3-4]。將干姜揮發油與β-環糊精制成包合物后，可明顯提高前者穩定性，使其生物利用度得到改善，并且相關工藝優化均采用正交試驗[5-8]，但它采用線性數學模型進行擬合，無法精確找到最佳點。Box-Behnken響應面法可充分考慮各因素之間的交互作用，提高實驗準確性和預測指導性[9]，故本實驗采用該方法對干姜揮發油膠體磨包合工藝進行優化，以期為該成分后續開發提供參考。

1 材料

1.1 儀器 JJ-1型增力電動攪拌器(江蘇杰瑞爾電器有限公司)；RK-501型旋轉蒸發器(鄭州科泰實驗設備有限公司)；JM-50M型膠體磨(溫州市膠體磨廠)；GZX-9240 MBE型電熱鼓風干燥箱(上海博迅實業設備廠)；TCS-30電子天平[梅特勒-托利多(常州)測量技術有限公司]；ALPHA型紅外掃描儀(德國布魯克公司)；芳香油提取罐(溫州市金榜輕工機械有限公司)。

1.2 試劑與藥物 干姜片(臨沂柯屹藥業有限公司，批號201110)，經魯南制藥集團中藥制藥共性技術國家重點實驗室范建偉高級工程師鑒定為正品。β-環糊精 (孟川市華興生物化工有限公司，批號20200209)。無水乙醇(南京化學試劑股份有限公司，批號201208762k)；水為蒸餾水(實驗室自制)。

2 方法與結果

2.1 揮發油制備 采用水蒸氣蒸餾法，稱取干姜飲片130.0 kg，投入芳香油提取罐中，加入8倍量水，開啟加熱，待提取罐內沸騰后調節蒸汽閥，提取揮發油5 h至油量不再增加后停止加熱，讀取揮發油量(360 mL)，開啟收集器活塞收集，加入等體積無水乙醇制成溶液，置于冷庫中保存備用。

2.2 包合物制備

2.2.1 飽和溶液法 精密稱取48.0 g β-環糊精，加入盛有1 375 mL蒸餾水的燒杯中，置于40 ℃水浴鍋中攪拌溶解，溶解后保持40 ℃恒溫。精密量取“2.1”項下揮發油乙醇溶液12 mL，置于分液漏斗中，調節活塞，逐滴加入，邊加邊攪拌，待油全部滴加結束后繼續攪拌2 h，放入冷庫中冷沉24 h以上，取出，真空抽濾，無水乙醇洗滌包合物3次，每次約30 mL，在40 ℃下烘干，即得。

2.2.2 超聲法 精密稱取48.0 g β-環糊精，加入盛有1 375 mL蒸餾水的燒杯中，置于40 ℃水浴鍋中攪拌溶解。精密量取“2.1”項下揮發油乙醇溶液12 mL，置于分液漏斗中，調節活塞，逐滴加入，邊加邊攪拌，待油全部滴加結束后在40 ℃下超聲包合2 h，放入冷庫中冷沉24 h以上，取出，真空抽濾，無水乙醇洗滌包合物3次，每次約30 mL，在40 ℃下烘干，即得。

2.2.3 膠體磨法 精密稱取48.0 g β-環糊精，加入240 mL蒸餾水攪拌均勻，制成β-環糊精混懸液，導入膠體磨中，待形成研磨循環后緩慢滴加“2.1”項下乙醇溶液12 mL，研磨20 min，放入冷庫中冷沉24 h以上，取出，真空抽濾，無水乙醇洗滌3次，每次約30 mL，在40 ℃下烘干，即得。

2.3 評價指標測定

2.3.1 空白回收率 按照2020年版《中國藥典》四部項下揮發油含量測定法(通則2204)甲法[10]，精密量取2.0 mL“2.1”項下揮發油乙醇溶液，置于1 000 mL圓底燒瓶中，加入500 mL蒸餾水、沸石若干，連接配套的發油測定器，置于電熱套中，開啟開關加熱煮沸，保持沸騰5 h，待油量不再增加時停止加熱，讀取收油量，平行3次，計算收率，取平均值。結果，揮發油空白回收率為80.33%。

2.3.2 包封率、收率 精密稱取“2.2”項下3種方法所得包合物總質量的1/6，量取500 mL蒸餾水加入圓底燒瓶中，再加入沸石若干，連接配套的揮發油測定器，置于電熱套開啟開關加熱煮沸，保持微沸狀態，待提取至測定器中油量不再增加后停止加熱，讀取揮發油量，換算為揮發油總體積，平行3次，取平均值，計算包封率、包合物收率，公式分別為包封率=[包合物中實際含油量/(揮發油投入量×空白回收率)]×100%、收率=[包合物質量/(β-環糊精投入量+揮發油投入量)]×100%。結果，飽和水溶液法、超聲法、膠體磨法所得揮發油的包封率分別為50.00%、37.50%、65.00%，收率分別為42.23%、28.15%、76.01%，可知膠體磨法上述指標最高，故選擇該方法包合揮發油。

2.4 單因素試驗

2.4.1 β-環糊精與揮發油比例 固定水與β-環糊精比例10∶1，研磨時間20 min，分別考察β-環糊精與揮發油比例4∶1、6∶1、8∶1、10∶1對包合工藝的影響，結果見表1。由此可知，β-環糊精與揮發油比例為4∶1～8∶1時包封率、收率均升高，為10∶1時兩者略微降低，故選擇6∶1～10∶1進行后續優化。

表1 β-環糊精與揮發油比例對包合工藝的影響

2.4.2 水與β-環糊精比例 固定β-環糊精與揮發油比例6∶1，研磨時間20 min，分別考察水與β-環糊精比例5∶1、10∶1、15∶1、20∶1對包合工藝的影響，結果見表2。由此可知，水與β-環糊精比例為5∶1～15∶1時包封率、收率均升高，為20∶1時兩者有所降低，故選擇10∶1～20∶1進行后續優化。

表2 水與β-環糊精比例對包合工藝的影響

2.4.3 研磨時間 固定β-環糊精與揮發油比例為6∶1，水與β-環糊精比例為10∶1，分別考察研磨時間10、20、30、40 min對包合工藝的影響，結果見表3。由此可知，研磨時間為10～30 min時包封率、收率均升高，為40 min時兩者略微降低，故選擇20～40 min進行后續優化。

表3 研磨時間對包合工藝的影響

2.5 Box-Behnken響應面法 在單因素試驗基礎上，以β-環糊精與揮發油比例(A)、水與β-環糊精比例(B)、研磨時間(C)為影響因素，包封率(R1)、收率(R2)及綜合評分(R綜)為評價指標，設計17個試驗點。由于包封率越高，包合物包合效果越好，故將其權重系數設定為0.7；收率在制備工藝中也有不可忽視的意義，當β-環糊精與揮發油投入量一定時，收率越高，包合物包合效果越好，故將其權重系數設定為0.3[11]，R綜=(揮發油包封率/最大值×0.7+包合物收率/最大值×0.3)×100[12]，結果見表4。

采用Design-Expert 8.0.6.1軟件對表4數據進行二次多元回歸擬合，得方程為R綜=-217.54+42.73A+6.31B+5.21C-0.17AB-0.16AC-0.04BC-2.05A2-0.10B2-0.05C2，方差分析見表5。由此可知，因素A、B、A2、C2均有極顯著影響(P<0.01)，C、B2、AC有顯著影響(P<0.05)，AB、BC無顯著影響(P>0.05)；失擬項P>0.05，R2=0.974 9，表明方程擬合度良好，誤差小，可用于分析預測；模型P<0.01，具有高度顯著性；各因素影響程度依次為A>B>C。

表4 試驗設計與結果

表5 方差分析

響應面分析見圖1。由此可知，當水與β-環糊精比例一定時，隨著β-環糊精與揮發油比例增加R綜逐漸升高，超過8∶1時開始降低；當β-環糊精與揮發油比例一定時，隨著水與β-環糊精比例增加R綜逐漸升高，超過17∶1時變化不明顯；當研磨時間一定時，隨著β-環糊精與揮發油比例增加R綜逐漸升高，超過8∶1時略微降低；當β-環糊精與揮發油比例一定時，隨著研磨時間延長R綜逐漸升高，超過30 min時開始降低；當研磨時間一定時，隨著水與β-環糊精比例增加R綜逐漸升高，超過17∶1時變化不明顯；當水與β-環糊精比例一定時，隨著研磨時間延長R綜逐漸升高，超過30 min時開始降低；因素A曲面較陡峭，表明對響應值影響顯著，其次是B、C；β-環糊精與揮發油比例、研磨時間交互作用顯著，與方差分析結果一致。

采用Design-Expert 8.0.6.1軟件，得到最優膠體磨包合工藝為β-環糊精與揮發油比例8.52∶1，水與β-環糊精比例17.59∶1，研磨時間30.38 min，結合實際情況，將其修正為β-環糊精與揮發油比例8∶1，水與β-環糊精比例17∶1，研磨時間30 min。按上述優化工藝進行3批驗證試驗，測得平均包封率、收率分別為90.12%、95.48%，與預測值接近(相對誤差分別為0.94%、0.86%)，表明該工藝穩定可靠。

2.6 包合物鑒別 采用衰減全反射法(ATR)，將揮發油、β-環糊精、包合物在4 000～400 cm-1波數范圍內進行紅外掃描，結果見圖2。由此可知，揮發油在1 376.12、1 464.06 cm-1處出現尖峰，而包合物中未發現這2個峰，表明形成了新物質；β-環糊精在3 302.97 cm-1處有寬峰，而包合物中該峰移至3 313.85 cm-1，并且峰形變窄，表明揮發油與β-環糊精之間發生相互作用，包合物制備成功。

3 討論與結論

Box-Behnken響應面法是響應面優化設計法中的一種，適合于用非線性模型擬合[12-14]，與正交試驗比較，它能在中心點進行重復性實驗，從而提高試驗精確度，更好體現各因素與效應值之間的關系[15]。本實驗比較了膠體磨法、飽和水溶液法、超聲法包合干姜揮發油的效果，發現膠體磨研磨包合法無需加熱，包合時間短，包合率高，既節省了時間，又降低了能源消耗，提高了揮發油利用率。

本實驗先采用單因素試驗確定了β-環糊精與揮發油比例、水與β-環糊精比例、研磨時間范圍，再通過Box-Behnken響應面法研究三者對評價指標的交互作用。結果，β-環糊精與揮發油比例對包合效果的影響程度最大，當它在一定范圍內時揮發油包封率和包合物收率逐漸升高，但超過范圍后開始下降，這是因為單位體積的揮發油分子數量是一定的，β-環糊精數量過少時揮發油未能完全被包合，導致包封率較低，而其數量過多時除了包合作用外，還會吸附部分揮發油，并且該成分易散失，乙醇洗滌也會除去，導致其包封率降低；水與β-環糊精比例的影響程度次之，當它在一定范圍內時揮發油包封率和包合物收率逐漸升高，但超過范圍后開始下降，這是因為用水量過少時研磨后包合物黏稠，流動性較差。

綜上所述，最優干姜揮發油膠體磨包合工藝為β-環糊精與揮發油比例8∶1，水與β-環糊精比例17∶1、研磨時間30 min，再通過紅外光譜法鑒別，驗證該工藝穩定可行，并且可節約時間，降低成本，適合大規模生產。