鹿茸大補湯對支氣管哮喘豚鼠的作用機制

金麗娜， 姜京植， 宋藝蘭， 李良昌， 延光海， 孟慶玲， 李 歡， 鄭明昱

(延邊大學醫學院，吉林省過敏性常見疾病免疫與靶向研究重點實驗室，吉林 延吉 133002)

支氣管哮喘(簡稱哮喘)是一種慢性的氣道炎癥性疾病，多種細胞可與上皮細胞相互作用，引起氣道高反應性、氣道炎癥和氣道重塑[1]，其發病機制與輔助性T細胞1(Th1)/輔助性T細胞2(Th2)失衡有關。普遍認為Th2型相關細胞因子，如IL-4、IL-5、IL-13等，在哮喘中占主導地位[2]。自噬是細胞的降解和再循環過程，是發生在真核細胞上由溶酶體介導并且高度保守的過程[3]。Th1/Th2細胞因子反應在自噬過程中起著調節作用[4]。Th1細胞因子刺激自噬，而Th2細胞因子抑制自噬[5]。UNC-51樣激酶1(ULK1)是啟動自噬的關鍵蛋白，可調節前自噬體的形成[6]，自噬相關蛋白6(Beclin-1)是自噬體形成過程中必需分子[7]，微管相關蛋白光鏈3(LC3)是自噬的標志物[8]，與自噬有密切的聯系。研究顯示，Th2型相關細胞因子對Beclin-1，LC3具有調節作用[9-11]。

鹿茸大補湯出自《東醫壽世保元》，具有補肺瀉肝、化痰平喘、標本兼顧功效，對哮喘緩解期患者有較好的療效[12-13]。課題組前期研究發現，鹿茸大補湯可以有效抑制哮喘氣道炎性細胞因子，改善肺組織損傷[14]。基于此，本實驗將從自噬角度探討鹿茸大補湯緩解哮喘的作用機制，為鹿茸大補湯防治哮喘提供實驗依據。

1 材料

1.1 動物 健康雄性豚鼠50只，體質量(200±30)g，由延邊大學醫學部實驗動物中心提供，實驗動物生產許可證號SCXK(吉)2017-0003。實驗前適應性喂養1周。

1.2 試劑與藥物 鹿茸大補湯由鹿茸10 g、麥冬7.5 g、薏苡仁7.5 g、麻黃5 g、山藥5 g、杏仁5 g、天冬5 g、五味子5 g組成，購于延吉市北京同仁堂藥店，經專家鑒定為正品，各藥材在蒸餾水中浸泡1 h后分別加10、8倍量水提取2次，每次1 h，旋轉蒸發儀濃縮至1∶1，備用。卵清蛋白(OVA)(貨號9006-59-1)、HE染色試劑盒(貨號G1120)、PAS染色試劑盒(貨號G1280)、Masson染色試劑盒(貨號G1345)購自北京索萊寶科技有限公司；氫氧化鋁凝膠(貨號77161)購自美國Thermo Fisher Scientific公司；免疫組化試劑盒(貨號pv-9000)購自北京中杉金橋生物技術有限公司；IL-4 ELISA試劑盒(貨號bsk12003)、IL-5 ELISA試劑盒(貨號bsk12019)、IL-13 ELISA試劑盒(貨號bsk12006)、LC3抗體(貨號bs-8878R)、ULK1抗體(貨號bs-3602R)、Beclin抗體(bsm-33323R)購自北京博奧森生物技術有限公司。

1.3 儀器 NE-C29型歐姆龍壓縮式霧化吸入器(大連藥材集團有限公司醫療器械廠)；041BR87950型垂直電泳儀及電泳槽、76120280型凝膠成像系統(美國Bio-Rad公司)；5404P806820型高速冷凍離心機(美國Sigma公司)；180222B EP-OCH型酶標儀、9.557.127 Cytation5型細胞成像微孔板檢測系統(美國Beckman公司)。

2 方法

2.1 分組與造模 將豚鼠隨機分為正常組，模型組，鹿茸大補湯低、高劑量組，地塞米松組。除正常組外，其余各組豚鼠腹腔注射1 mL 10%卵清蛋白致敏液(OVA和氫氧化鋁)致敏，每周1次，共2次。第21天時，模型組，鹿茸大補湯低、高劑量組及地塞米松組豚鼠再腹腔注射1%卵清蛋白溶液，超聲霧化激發，每次至少30 min，每周3次，連續8周。第21天起，正常組、模型組豚鼠于激發前1 h灌胃給予生理鹽水，鹿茸大補湯高、低劑量組豚鼠灌胃給予20、5 g/kg鹿茸大補湯(分別為臨床等效劑量的1、4倍)，地塞米松組豚鼠灌胃給予5 g/kg地塞米松，每天1次，連續8周。在灌胃過程中豚鼠無死亡，每組最終納入數量均為10只[15-16]。

2.2 取材 末次給藥24 h后處死豚鼠，即刻打開胸腔，暴露氣管，回收BALF，3 000 r/min離心5 min，并取上清液，在-80 ℃下冷凍保存，剩余沉淀物用于細胞涂片，Diff-Quick染色，在光學顯微鏡下進行炎癥細胞分類及計數。取豚鼠左肺上葉，在-80 ℃下保存；取左肺中葉，在4%多聚甲醛溶液中進行固定。

2.3 豚鼠BALF中炎性細胞因子水平檢測 取豚鼠BALF，解凍后制備洗滌液，稀釋標準品，孔內加入樣品和抗體進行孵育，再依次加入工作液、顯色底物進行孵育，最后加入終止液，用酶標儀檢測吸光度值，并計算BALF中IL-4、IL-5、IL-13水平。

2.4 豚鼠肺組織病理學觀察 取豚鼠左肺中葉，石蠟包埋切片，常規固定、脫水，進行HE、PAS、Masson染色，觀察其組織病理學變化。

2.5 免疫組織化學染色檢測ULK1蛋白表達 將肺組織石蠟切片置于60 ℃烤箱中熔蠟以增加切片附著度，脫蠟，脫水，微波加熱抗原修復，緩沖液冷卻并清洗，一抗、生物酶標記的二抗孵育，DAB顯色，蘇木復染，脫水，中性樹膠封片，觀察肺組織ULK1蛋白陽性表達。

2.6 Western blot檢測LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ、ULK1、Beclin-1蛋白表達 提取豚鼠肺組織蛋白，采用BCA法檢測濃度，煮沸5 min后經8%、10%、12%、15% SDS-PAGE電泳，轉膜，5%脫脂奶粉-TBST溶液常溫封閉1 h，加入一抗4 ℃過夜，洗膜后加入相應二抗，常溫搖床孵育2 h，將膜取出后用ECL試劑曝光，分析蛋白相對表達。

2.7 免疫熒光法檢測ULK1、LC3蛋白表達 將標本置于60 ℃烤箱中熔蠟以增加切片的附著度，脫蠟，脫水，微波加熱抗原修復，一抗孵育過夜，清洗后用熒光二抗孵育，最后加入DAPI封片，在微孔成像儀下觀察拍照。

3 結果

3.1 鹿茸大補湯對豚鼠BALF中炎癥細胞數的影響 與正常組比較，模型組豚鼠BALF中炎癥細胞總數及中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、淋巴細胞、巨噬細胞數增加(P<0.05)；與模型組比較，鹿茸大補湯各劑量組和地塞米松組豚鼠BALF中炎癥細胞總數及中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、淋巴細胞、巨噬細胞數減少(P<0.05)，見圖1。

3.2 鹿茸大補湯對豚鼠BALF中炎性細胞因子水平的影響 與正常組比較，模型組豚鼠BALF中IL-4、IL-5、IL-13水平升高(P<0.05)；與模型組比較，鹿茸大補湯各劑量組和地塞米松組豚鼠BALF中IL-4、IL-5、IL-13水平降低(P<0.05)，見圖2。

3.3 鹿茸大補湯對豚鼠肺組織病理變化的影響 HE染色顯示，正常組豚鼠氣道無明顯改變；模型組豚鼠氣道壁及氣道平滑肌明顯增厚，黏膜下層增寬，黏膜上皮增生，管腔被黏液所堵塞；鹿茸大補湯各劑量組和地塞米松組豚鼠雖可見炎癥細胞浸潤等病理表現，但較模型組有所減輕。PAS染色顯示，與正常組比較，模型組豚鼠出現明顯的杯狀細胞增生與黏液分泌；與模型組比較，鹿茸大補湯各劑量組和地塞米松組豚鼠上述情況有所減輕。Masson染色顯示，正常組豚鼠氣道周圍膠原纖維沉積較少；模型組豚鼠氣道周圍膠原纖維沉積增多；鹿茸大補湯各劑量組和地塞米松組豚鼠氣道周圍膠原纖維沉積減少，見圖3。

3.4 鹿茸大補湯對豚鼠肺組織ULK1蛋白表達的影響 與正常組比較，模型組豚鼠氣道周圍ULK1聚集明顯；與模型組比較，鹿茸大補湯各劑量組和地塞米松組豚鼠ULK1聚集程度有所減弱，見圖4。

3.5 鹿茸大補湯對豚鼠肺組織LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ、ULK1、Beclin-1表達的影響 與正常組比較，模型組豚鼠肺組織LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、ULK1、Beclin-1表達升高(P<0.05)；與模型組比較，鹿茸大補湯各劑量組和地塞米松組豚鼠肺組織LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、ULK1、Beclin-1表達降低(P<0.05)，見圖5。

3.6 鹿茸大補湯對豚鼠肺組織ULK1、LC3蛋白表達的影響 與正常組比較，模型組豚鼠肺組織ULK1、LC3蛋白表達升高；與模型組比較，鹿茸大補湯各劑量組和地塞米松組豚鼠肺組織ULK1、LC3蛋白表達降低，見圖6。

4 討論

哮喘是一種常見的全球性呼吸系統疾病，發病率和死亡率都很高。本研究利用OVA誘導哮喘豚鼠模型來探索鹿茸大補湯對哮喘氣道炎癥的影響。以地塞米松為陽性對照藥物，觀察了鹿茸大補湯對哮喘豚鼠肺部炎癥的影響。HE染色可以觀察到鹿茸大補湯能減輕OVA誘導后氣道周圍炎性細胞浸潤；PAS染色顯示鹿茸大補湯能減輕杯狀細胞增生與黏液分泌；Masson染色證明鹿茸大補湯可以減輕氣道周圍膠原纖維增生。以上研究結果顯示，鹿茸大補湯能改善OVA誘導的哮喘豚鼠的肺部炎癥。

Th1/Th2細胞亞群的失衡是哮喘的發病機制之一，已知Th2型相關細胞因子可促進哮喘患者肺部嗜酸性粒細胞的積累[17]。研究顯示，IL-13促進氣道杯狀細胞分泌過量黏液，激活上皮細胞自噬，相反，抑制自噬能降低IL-13誘導的氣道黏液分泌，降低IL-5表達，減少BALF中嗜酸性粒細胞數量[10,18]。本研究結果顯示，OVA誘導哮喘豚鼠中炎性細胞因子水平升高，而鹿茸大補湯可以減少炎性細胞因子的表達，證實其對哮喘有抗炎作用。

支氣管哮喘屬朝鮮族醫學的“哮喘”范疇。李濟馬根據臟腑的虛實，將人分為4種體質。其中太陰人以“肝大肺小”為臟腑功能特點，因其“肺小”在四象人中最易患肺部疾病，因此太陰人哮喘應以補肺瀉肝為治法。鹿茸大補湯為太陰人方劑，方中以鹿茸為主藥補肺、益精血；麥門冬、薏苡仁、五味子、山藥為輔藥補肺健胃，助鹿茸益精血；天門冬潤肺滋腎；杏仁止咳平喘；麻黃解肺之表邪[14]。諸藥合用共湊補肺瀉肝，化痰平喘，標本兼顧之功效，符合朝鮮族醫學“藥乃局限于人”的藥性觀。

自噬是一個高度保守的基本進化過程，在細胞生長發育、適應性免疫系統及程序化細胞死亡中起著至關重要的作用[19]。研究顯示，自噬可能是哮喘發展的一個重要因素，減少肺組織自噬可以改善哮喘[20]。自噬涉及哮喘發病機制的幾個關鍵特征，包括嗜酸性氣道炎癥、氣道高反應性和氣道重塑[21-22]。ULK1和ATG13是自噬啟動的關鍵調節蛋白[23]。研究表明，小鼠因缺乏ULK1基因導致自噬功能受到抑制[24]。Beclin-1作為哺乳動物中Atg6的同源蛋白，是ULK1下游的直接靶點，Beclin-1可以從干預自噬體的形成至成熟[25]。LC3-Ⅰ是通過從新合成的LC3中去除C末端的22個氨基酸而形成的，然后將一部分LC3-Ⅰ轉化為LC3-Ⅱ，因此常用LC3-Ⅱ與LC3-Ⅰ比值來評估細胞的自噬表達[8]。本研究發現，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1、ULK1在OVA誘導的哮喘豚鼠中呈高表達，表明自噬與哮喘氣道炎癥的發病機制之間存在聯系；而經鹿茸大補湯治療后LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、ULK1、Beclin-1表達被抑制，表明鹿茸大補湯可能是通過抑制自噬從而抑制哮喘氣道炎癥。

綜上所述，鹿茸大補湯可能通過抑制ULK1信號通路對自噬起調節作用，減輕哮喘豚鼠氣道周圍炎性細胞浸潤，從而改善哮喘豚鼠氣道炎癥反應，緩解哮喘。本次研究仍存在一定的局限性，為了進一步了解鹿茸大補湯在該通路的作用機制，還需要多途徑、多靶點深入研究。