八味沉香散對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用

李永慧， 朱 琳， 寇毅英， 李永芳*

(1.青海省西寧市第一人民醫院，青海 西寧 810000；2.青海大學醫學院，青海 西寧 810001)

近年來，急性心肌梗塞的發病率與死亡率明顯上升，嚴重威脅人類的生命健康[1-2]。迅速恢復血供，即再灌注治療是挽救急性心肌梗死的根本措施。但恢復血供又可造成或加重心肌細胞的損傷，即心肌缺血再灌注損傷，成為再灌注療法獲益的主要障礙[3-4]。因此，尋找安全有效的治療藥物，提高急性心肌梗塞的再灌注治療療效，顯得尤為重要。藏藥八味沉香散具有消心熱、寧心安神、醒腦開竅之功效，是藏醫臨床治療冠心病心絞痛的經典常用藏醫藥方。研究發現，八味沉香散能明顯改善異丙腎上腺素和垂體后葉素引起的心肌缺血損傷[5-7]，但其對心肌缺血再灌注損傷是否也具有保護作用還待進一步研究。本實驗擬采用在體冠狀動脈結扎法建立大鼠心肌缺血再灌注損傷模型，研究八味沉香散抗心肌缺血再灌注損傷作用，以期為八味沉香散防治心肌缺血再灌注損傷提供實驗依據，開拓藏藥在治療缺血性心臟病的領域。

1 材料

1.1 動物 健康SD大鼠，清潔級，體質量220～280 g，由西安交通大學醫學院實驗動物中心提供，實驗動物生產許可證號SCXK (陜) 2017-003。

1.2 試劑與藥物 八味沉香散(批號20171107)，購自西藏神猴藥業有限責任公司，取適量用蒸餾水分別配置成0.4、0.8、1.6 g/kg藥液(低、中、高劑量)，備用。肝素鈉(批號170512)，購自北京博奧拓達科技有限公司；2,3,5三苯基氯化四氮唑(TTC)(批號922G037)，購自北京索萊寶科技有限公司；烏拉坦(批號130412)，購自國藥集團化學試劑上海有限公司；乳酸脫氫酶 (LDH)、肌酸激酶 (CK)試劑盒(批號20170025)，購自南京建成生物工程研究所。

1.3 儀器 DHX-150型動物呼吸機，購自成都儀器廠；Powerlab型數據采集分析系統，購自澳大利亞AD Instruments公司；723P型紫外-可見分光光度計，購自上海光譜儀器有限公司；水浴鍋，購自上海醫大儀器有限公司；TGL-16gR型高速離心機，購自上海安亭科學儀器廠。

2 方法

2.1 分組與給藥 大鼠隨機分為假手術組、模型組和八味沉香散低、中、高劑量組(0.4、0.8、1.6 g/kg)，每組10只。八味沉香散各劑量組大鼠灌胃給予相應劑量八味沉香散藥液，假手術組和模型組灌胃給予等量蒸餾水，每天1次, 連續10 d。末次灌胃后1 h，除假手術組大鼠不結扎左冠狀動脈外，其余各組大鼠均行心肌缺血再灌注損傷。

2.2 缺血再灌注模型制備 大鼠以20%烏拉坦 (0.4 mL/100 g) 腹腔注射麻醉，仰位固定，四肢皮下插入針式電極，持續記錄肢體二導聯心電圖，切開氣管、插管并連接動物呼吸機(頻率70～80次/min，潮氣量 2～3 mL/100 g，呼吸比 2∶1)，穩定10 min后，開胸、剪開心包、暴露心臟，于左心耳下緣肺動脈圓錐旁以6-0無創縫合線穿過左冠狀動脈前降支(LAD)，穩定10 min后，結扎左冠狀動脈，以心電圖ST段抬高或T波高聳作為結扎成功的標志，心肌缺血30 min后打開結扎線進行復灌，抬高的ST段降低或高聳的T波恢復表示心肌再灌注成功，再灌注60 min，制備大鼠心肌缺血再灌注模型。

2.3 血清LDH、CK活性檢測 大鼠心肌缺血再灌注結束后，腹主動脈取血，3 000 r/min離心15 min，取血清，置于-80 ℃冰箱保存，按試劑盒說明檢測血清LDH、CK活性。

2.4 心肌梗死范圍檢測 大鼠腹主動脈取血后，摘取心臟，剔除血管、脂肪等非心肌組織，濾紙吸去心表水分。平行房室溝，將心臟切成1.5～2.0 mm薄片，共5片，切片在37 ℃預溫的含1% TCC的Tris-HCl緩沖液中染色15 min，取出切片以4%甲醛溶液固定1 h，正常心肌呈紅色，梗死心肌呈灰白色，分別稱定正常、梗死心肌質量，計算梗死心肌占整個心肌(梗死心肌與正常心肌之和)的質量百分比, 即心肌梗死范圍。

2.5 心肌組織病理學檢測 每組取4只大鼠，心肌缺血再灌注后取心臟，置于10%甲醛溶液中固定，石蠟包埋、切片，進行HE 染色，光學顯微鏡下觀察心肌組織形態學變化。該實驗由青海省康樂醫院完成。

2.6 心肌超微結構觀察 每組取4只大鼠，心肌缺血再灌注后取心臟，樣品經3%戊二醛預固定，1%四氧化鋨再固定，丙酮逐級脫水，Epon812包埋，半薄切片光學定位，超薄切片，醋酸鈾及枸櫞酸鉛雙重染色，日立H-600IV型透射電鏡觀察。該實驗由四川大學華西醫學檢測所完成。

3 結果

3.1 八味沉香散對缺血再灌注大鼠血清LDH、CK活性的影響 如表1所示，與假手術組比較，模型組大鼠血清LDH、CK活性升高(P<0.01)；與模型組比較，八味沉香散各劑量組大鼠血清LDH、CK活性降低(P<0.05，P<0.01)。

表1 八味沉香散對大鼠血清LDH、CK活性的影響

3.2 八味沉香散對缺血再灌注大鼠心肌梗死范圍的影響 如表2所示，與假手術組比較，模型組大鼠心肌梗死范圍增加(P<0.01)；與模型組比較，八味沉香散中、高劑量組大鼠心肌梗死范圍減少(P<0.05，P<0.01)，八味沉香散低劑量組大鼠心肌梗死范圍減少，但差異無統計學意義(P>0.05)。

表2 八味沉香散對缺血再灌注大鼠心肌梗死范圍的影響

3.3 八味沉香散對缺血再灌注大鼠心肌組織病理學的影響 如圖1所示，假手術組大鼠心肌組織無變性、壞死，間質未見水腫及炎細胞浸潤；模型組大鼠心肌細胞橫紋不清晰，部分心肌纖維斷裂，心肌間質可見炎細胞浸潤，水腫明顯，血管擴張，心肌組織有點片狀壞死，可見灶性出血；與模型組比較，八味沉香散各劑量組大鼠心肌細胞核大致正常、心肌纖維排列基本整齊，心肌間質炎癥細胞浸潤減少，細胞間隙水腫減輕, 低劑量組心肌組織有少量點狀壞死和出血，中、高劑量組大鼠心肌組織未見壞死；且八味沉香散高劑量組大鼠心肌纖維損傷、間質炎癥細胞浸潤、細胞間隙水腫等病變情況較低、中劑量組更輕。

3.4 八味沉香散對缺血再灌注大鼠心肌超微結構的影響 如圖2所示，假手術組大鼠心肌細胞的結構正常，肌膜完整，心肌纖維排列有序，線粒體結構清晰、完整；模型組大鼠心肌細胞結構異常，胞漿內線粒體明顯腫脹，呈現空泡化，部分肌纖維有溶解；八味沉香散低、中劑量組大鼠心肌細胞受損比模型組輕，但部分線粒體出現腫脹；八味沉香散高劑量組大鼠心肌細胞結構基本正常，線粒體結構清晰與假手術組比較無明顯差異。

4 討論

再灌注是治療急性心肌梗塞的主要措施，但大量研究表明，再灌注不一定會使缺血損傷的組織細胞得到恢復，在一定條件下反而造成或加重心肌細胞的損傷[8]，即心肌缺血再灌注損傷。藥物預/后處理、缺血預/后處理、遠距離缺血預處理等措施可以有效減輕心肌缺血再灌注的損傷程度，縮小損傷范圍[9-11]。但急性心肌梗塞發生的不可預知性限制了缺血預/后處理、遠距離缺血預處理在再灌注治療中的實際應用，相比較而言，藥物預/后處理具有較安全、使用方便、易控制等優點，因此，開發安全有效的抗心肌缺血再灌注損傷藥物具有重要意義。

八味沉香散收載于《中華人民共和國衛生部藥品標準·藏藥》，氣芳香，味咸、澀、微苦，具有活血止痛、清心熱、養心、安神、開竅的功效，是藏區臨床廣泛用于治療冠心病、心絞痛的藏成藥[12]。現代研究發現，八味沉香散水提液、95%醇提物、50%醇提物能明顯改善異丙腎上腺素和垂體后葉素引起的大鼠心電圖、血流動力學、血清酶和組織病理學改變，減輕線粒體結構損傷[5-7]。本研究通過冠狀動脈結扎法建立在體大鼠心肌缺血再灌注損傷模型，探討了八味沉香散對心肌缺血再灌注損傷的保護作用。

心肌細胞內有大量的CK和LDH，當心肌發生缺血再灌注損傷時，心肌細胞膜通透性增加，心肌中大量CK、LDH釋放到血液，使血清中CK、LDH水平升高，導致活性增高，因此，血清中CK、LDH活性可反映心肌細胞受損程度[9]。本實驗結果顯示，與模型組比較，八味沉香散各劑量組大鼠血清CK、LDH活性均降低，說明八味沉香散可在一定程度上減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷，減少心肌細胞CK、LDH的漏出。

心肌梗死范圍是評價心肌缺血再灌注損傷程度的一個重要指標。本實驗結果顯示，八味沉香散預防給藥能降低大鼠心肌缺血再灌注引起的心肌梗死范圍，改善心肌缺血再灌注損傷中心肌組織的炎細胞浸潤、水腫及心肌細胞結構改變，進一步證實了八味沉香散對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用。

線粒體是細胞能量產生的重要細胞器，是缺血再灌注損傷的關鍵靶點，已經成為心肌損傷的關鍵參與者和調節者[13]，主要表現為三磷酸腺苷合成減少、活性氧產生過多、Ca2+超載及心肌細胞的凋亡等，進一步損傷線粒體及心肌細胞結構和功能[14]，也成為中醫藥治療的重要靶點[15-16]。本實驗結果顯示，八味沉香散能減輕大鼠心肌缺血再灌注引起的線粒體腫脹、空泡和結構改變，說明八味沉香散抗大鼠心肌缺血再灌注損傷作用可能是通過保護心肌線粒體而發揮的，但保護線粒體的分子機制有待進一步研究。