基于生物信息學對過敏性紫癜靶點的篩選

馬 躍， 孔 涵， 張善云， 刁娟娟

(1.山東中醫藥大學，山東 濟南 250014；2.山東中醫藥大學附屬醫院，山東 濟南 250011)

過敏性紫癜(Henoch-Schonlein purpura)是一種以IgA沉積為主的系統性小血管炎[1]。學齡前期及學齡期兒童最為多見，發病率呈逐年上升趨勢[2]，可引起腹痛、紫癜、關節痛等，且部分患者伴有腎損傷等癥狀，甚至可以發展為腎功能不全。過敏性紫癜的病因和發病機制尚不完全清楚，可能與體液免疫紊亂、T細胞亞群功能失調、凝血與纖溶機制紊亂等有關[3]。臨床上多應用抗感染、抗過敏、抗血小板聚集等的綜合療法。對于存在嚴重腹痛、關節痛等癥狀，應用糖皮質激素類藥物，但非選擇性抑制作用導致對免疫系統與代謝產生改變，導致白內障、高血壓和體重增加等，同時只能用于緩解癥狀，不能降低腎損傷的風險，停藥后復發率較高[4]。因此，需要明確過敏性紫癜的發病機制，探索可能的靶點和靶向治療藥物，對于制定更有效的診斷和治療策略至關重要。

1 方法

1.1 檢索疾病靶點 在NCBI數據庫中，以“Henoch-Schonlein purpura”為關鍵詞，并且限定物種為“Homo sapiens”，檢索出與過敏性紫癜相關的基因。

1.2 篩選KEGG通路 DAVID是一個在線生物學知識庫，為研究人員提供一套全面的功能注釋工具[5]。將檢索出的過敏性紫癜疾病相關的靶點，輸入DAVID數據庫，限定獲得過敏性紫癜相關靶點的KEGG信號通路。為了使結果具有高度可靠性，因此篩選出P<0.01的疾病通路。

1.3 構建蛋白互作網絡 STRING是一個用于探索和分析蛋白質之間相互作用在線工具[6]。統計富集在每條通路上的過敏性紫癜的靶點，篩選出富集在P<0.01通路上的非冗余靶點和出現頻次高(頻率>10)的靶點，同時在CTD數據庫驗證非冗余靶點與疾病的相關性。非冗余靶點通過STRING數據庫，篩選出度值較高的高度值非冗余靶點。

1.4 核心靶點篩選 將篩選出的高度值非冗余靶點與高頻靶點取交集，作為過敏性紫癜的重要靶點。再將重要靶點通過STRING數據庫獲取高度值的核心靶點。

1.5 篩選中藥和中醫癥狀 將核心靶點依次輸入Symmap數據庫查找每個核心靶點所對應的P<0.05的Herb和TCM symptom相關條目，導出、篩選并分析高頻次的中藥、中藥分類以及中醫癥狀。

1.6 核心靶點的GO功能和KEGG通路分析 將核心靶點進行GO功能分析和KEGG通路分析，獲得GO功能的生物過程(BP)，細胞組分(CC)，分子功能(MF)以及相關KEGG信號通路。

2 結果

2.1 篩選靶點基因 在NCBI數據庫中共篩選出75個過敏性紫癜靶點。

2.2 篩選KEGG通路 獲得過敏性紫癜相關靶點P<0.05的KEGG通路54個，P<0.01的KEGG信號通路40個，見圖1。

2.2.1 細胞因子-細胞因子受體交互作用 細胞因子-細胞因子受體交互作用(Cytokine-cytokine receptor interaction，CCI)網絡是機體信號轉導系統的重要組成，在改善機體炎性反應及調節免疫功能中有重要作用[7]。CCI主要富集表現在趨化因子和TNF家族中，通過趨化因子信號梯度，在過敏性紫癜的病理過程中起重要作用。CXC趨化因子配體16(CXCL16)主要在抗原提呈細胞表面表達，可以通過受體特異性結合激活T細胞、自然殺傷細胞進而提高T細胞的增殖、遷徙及浸潤，促進局部的炎癥反應[8-9]。同時INF、TNF等炎癥細胞因子也可以進一步促使CXCL16的表達水平上調，調控炎癥水平。通過觀察過敏性紫癜患者血清、尿液中CXCL16，發現CXCL16可以作為早期診斷過敏性紫癜的敏感指標，且CXCL16水平與尿蛋白定量呈正相關性，也可作為預測紫癜性腎炎病情嚴重程度的指標之一[10]。

2.2.2 T細胞受體信號通路 T細胞受體信號通路在形成T細胞功能和免疫突觸中起到關鍵作用，在抵抗感染的適應性免疫反應中發揮著至關重要的作用[11]。T細胞受體激活CD4+T細胞，分化為Th1、Th2和Th17細胞亞群和Treg細胞。通過研究過敏性紫癜患者外周血T細胞亞群及其相關細胞因子等的變化，發現過敏性紫癜患者存在Th1/Th2失衡，大量合成、分泌IgA，出現異常免疫應答引起免疫損傷[12]。通過T細胞受體通路調節T細胞增殖，能夠改善過敏性紫癜的細胞及體液免疫紊亂[13]。霉酚酸酯可能通過調控T-bet/GATA3表達，恢復過敏性紫癜小鼠Th1/Th2平衡，控制并改善過敏性紫癜的癥狀[14]。Th1/Th2、Th17/Treg的平衡在免疫調節中發揮重要作用。因此，在過敏性紫癜病理過程中，細胞因子失衡對機體造成的潛在損傷不容忽視，應當在治療中密切監測。

2.2.3 Toll樣受體信號通路 TLR2、TLR4是TLRs家族的兩個主要成員，與相應的配體接觸后，通過信號傳導促進IL6、IL8、IL10等，引起中性粒細胞趨化聚集，使毛細血管通透性增加導致炎癥損傷，促進免疫功能紊亂，與過敏性紫癜的發生發展密切相關[15]。此外TLR通過多種機制參與Th1/Th2免疫應答平衡，對維持內環境穩定具有重要意義。通過調控Toll樣受體信號通路，提高TLR2蛋白表達率，能夠改善細胞免疫功能[16]。因此以TLR為靶點治療過敏性紫癜可能是一種新的治療策略。

2.2.4 NF-κB信號通路 TNF-α可以通過激活NF-κB，抑制內皮型一氧化氮合酶(eNOS)的釋放，活化的NF-κB誘導TNF-α等促炎因子的產生[17]。NF-κB影響下游氧化應激反應及細胞免疫應答，通過上調MMP-3、MMP-9的表達，可降解血管系膜使得內皮細胞通透性增強，造成血管內皮屏障損傷，促進炎癥因子的產生[18]。

2.3 PPI網絡構建 將40條通路整理歸類并統計后獲得44個非冗余靶點、高度值非冗余靶點18個、高頻靶點10個。同時在CTD數據庫對非冗余靶點與疾病的相關性進行驗證并繪制熱圖，相關性分數越高代表該靶點與疾病的相關性越好(見圖2)。非冗余靶點和高頻靶點蛋白互作圖見圖3～4，其中度值越大，顏色越深且圖標越大。

2.4 核心靶點篩選 過敏性紫癜核心靶點10個，分別為IL10、IL6、TNF、CXCL8、TLR4、TLR2、IL18、IL1B、IFNG、CD40LG，利用STRING數據庫進行蛋白相互作用，獲得PPI網絡(見圖5)。

2.5 篩選中藥和中醫癥狀 含有大于7項的中藥共70味，20種中藥分類主要有清熱解毒藥、活血祛瘀藥、清熱燥濕藥、清熱瀉火藥、補益藥(陽、氣、陰)、祛風濕散寒藥、理氣藥等，中藥主要有金銀花、連翹、黃芪、板藍根、小薊等，同時獲得P<0.05的高頻詞中醫癥狀28個，主要有斑疹、關節痛、腹痛、頭痛等(圖6～7)。

2.6 GO功能和KEGG通路分析 通過GO分析，過敏性紫癜的關鍵靶點主要涉及其對細胞因子的正調控、MyD88依賴的Toll樣受體信號轉導，中性粒細胞的趨化性，T細胞增殖的正調控、一氧化氮生物合成過程等生物過程(圖8)。通過KEGG通路分析，這些重要靶點在細胞因子-細胞因子受體相互作用、Toll樣受體信號通路、NF-κB信號通路等信號通路中發揮重要作用(圖9)。

4 討論

中醫診療方案將過敏性紫癜分為風熱傷絡、血熱妄行、濕熱痹阻、陰虛火旺、氣不攝血、氣滯血瘀，以“濕、熱、瘀”為主的辨證思路，治療以祛濕清熱、涼血化瘀為主。通過對重要靶點基因預測的中藥及其歸類進行統計分析，發現以清熱解毒藥、活血祛瘀藥頻數最高，如金銀花、連翹、黃芪等。金銀花、連翹具有廣譜抗菌、抗病毒、解熱鎮痛及抑制毛細血管通透性的作用[19]。由金銀花、連翹組成的銀翹散，為風熱傷絡的主方。對過敏性紫癜采用營衛論治、三焦辯證共同選方銀翹散加減為治衛氣分證與上焦證，臨床療效佳[20-21]。近年來血瘀理論的提出在過敏性紫癜的診療進程中尤為重要，以小薊為主要藥物的經典方劑小薊飲子，為血熱妄行證的首選方劑。許華教授[22]自擬消癜湯加減，其中小薊、牡丹皮等具有活血化瘀藥物的使用，更體現了“熱毒”致瘀、從瘀論治過敏性紫癜的觀點。黃芪具有抗氧自由基作用，保護腎小球基膜屏障、改善血管微循環[23]。補中益氣湯、歸脾湯、黃芪顆粒、玉屏風散可以健脾益氣補血，有效調節患兒免疫功能，有效降低過敏性紫癜復發率[24-26]。過敏性紫癜當分為兩期論治，正虛階段多見于陰虛火旺、氣陰兩虛，常應用補益藥類似黃芪、桑寄生、女貞子等，邪實階段宜用疏風、清熱、涼血等治法，常選用金銀花、連翹、赤芍等清熱涼血之品[27]。過敏性紫癜以斑疹(紫黑、色淡)、關節疼痛(刺痛、腫痛、鈍痛)、腹痛(綿綿、冷痛)、發熱(烘熱、低熱、身熱)、五心煩熱、頭痛等為主要表現，對應病機體現血瘀、氣滯、氣陰不足等。中醫以辨證論治為基礎，臨床選方上具有靈活性，多成分，多靶點，多通路發揮作用。

免疫炎癥反應及氧化應激在過敏性紫癜的發病機制和進展中起關鍵作用[28]。早期清除急性期的炎癥介質可能有助于緩解腎臟損害并改善過敏性紫癜的臨床癥狀。IL6的表達水平與過敏性紫癜的發生有相關性，并且與腎臟受累的嚴重程度直接相關[29]。通過血流灌注可有效減少IL6、TNF-α等，改善腎臟損害與病情發展[30]。過敏性紫癜患兒本身存在T細胞功能紊亂，Th17過度活化，Treg生成減少，IL6等過度表達破壞Th17/Treg平衡[31]。B10細胞與過敏性紫癜的發生和嚴重程度有關，CD40-CD40L信號通路可誘導B細胞產生IL10，刺激調節性B細胞的產生[32]。在TWEAK的刺激下產生促炎作用，導致血管周圍白細胞浸潤與內皮損傷[33]。阻斷TWEAK能抑制炎癥浸潤減少趨化因子的產生，這可能為過敏性紫癜治療提供新的治療策略。達培酮通過抑制IL-8的釋放與趨化作用，破壞IgA和IgG的合成，起到抗氧化劑清除劑、抗炎作用，可作為過敏性紫癜的替代療法[34]。免疫復合物激活相關信號通路抑制IL6、IL10、TNF等細胞因子的釋放及免疫應答。

本研究對過敏性紫癜進行生物信息學分析，初步確定過敏性紫癜發病中的關鍵靶點和途徑，為過敏性紫癜的精準治療提供理論依據。