腫瘤干細胞與肺腺癌EGFR-TKI 獲得性耐藥機制的研究進展

陳 雨 陳 杰 李亞軍▲

1.遵義醫科大學第三附屬醫院 遵義市第一人民醫院腫瘤科，貴州遵義 563000；2.遵義醫科大學第三附屬醫院 遵義市第一人民醫院泌尿外科，貴州遵義 563000

肺癌是全世界最常見的惡性腫瘤之一，也是發病率和死亡率增長最快的惡性腫瘤，絕大部分為非小細胞肺癌，非小細胞肺癌又可分為大細胞癌、鱗狀細胞癌和腺癌，其中腺癌以表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）突變率在肺癌患者中占比最高，約占50.2%[1]。在臨床中，尤其是中晚期EGFR突變的肺腺癌患者，分子靶向治療是其主要的方法[2]。表皮生長因子受體激酶抑制劑（epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKI）是針對EGFR 突變的肺腺癌患者臨床常用的靶向藥物，包括吉非替尼、厄洛替尼、阿法替尼等。然而，絕大多數EGFR 突變的肺腺癌患者在靶向治療1～2 年出現耐藥，繼而腫瘤進展、復發，影響了肺腺癌患者的整體治療效果[3]。肺腺癌EGFR-TKI 耐藥，是目前研究較多，進展較快的一類靶向藥，其中最著名并且獲得廣泛認可的機制是T790M 突變，約占獲得性耐藥機制的60%，其余的耐藥機制包括c-Met 擴增、上皮-間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）、向小細胞肺癌的轉化等，對EGFR-TKI 的內在抗性和其他獲得性耐藥機制還不完全清楚[2,4-5]。

近年來，隨著腫瘤干細胞（cancer stem cell，CSC）研究的進展，有研究學者認為，肺癌靶向治療中耐藥的產生可能是由于CSC 的存在。CSC 不同于一般的腫瘤細胞，其具有較強的自我更新和分化的能力，在腫瘤形成、進展、轉移及耐藥等方面起著重要的作用。因此，有研究學者提出CSC 與肺腺癌EGFR-TKI 獲得性耐藥機制有一定關系，也成為當前克服耐藥的關鍵及目前的研究熱點[6]。因此本文主要綜述近年來CSC與肺腺癌EGFR-TKI 獲得性耐藥機制的相關性的研究進展。

1 肺癌干性標志物調控肺癌干細胞干性介導EGFRTKI 耐藥

CSC 理論的出現，從新的視角為肺癌發生及復發提供了合理的解釋，該理論認為肺癌存在CSC，CSC是腫瘤細胞的一小部分，其具有自我更新、無限增殖和分化潛能的能力，且具有促進腫瘤生長、復發、轉移及放化療抵抗的作用[7]。研究證明，CSC 可以表達多種干性標志物，如CD133、乙醛脫氫酶（aldehyde dehydrogenase，ALDH）、ABC 轉運蛋白等[8]。近年來，研究發現肺癌干細胞與肺腺癌EGFR-TKI 耐藥存在著一定關系[9]。進一步研究顯示肺癌干細胞標志物通過調控肺癌干細胞干性進而與肺腺癌EGFR-TKI 耐藥有關，主要進展如下：

1.1 CD133

CD133 是Prominin 細胞表面蛋白家族成員之一，是一個含5 次跨膜結構的分子量為120 kb 的糖蛋白。CD133 廣泛存在于多種CSC 中，目前在肝癌、結腸癌、肺癌中被證實為CSC 標志物，其陽性表達率與腫瘤惡性程度密切相關[10]。據研究顯示，源自肺腺癌細胞系的耐藥細胞富含CD133 陽性細胞，并顯示出更高水平的血管生成因子，從而導致CSC 的致瘤和轉移潛力增加[11]。Shao 等[12]研究發現，在肺腺癌一代EGFR-TKI 埃克替尼耐藥細胞株，其干細胞標志物CD133 高表達，并且更能有效形成球體。近期研究報道[13-14]肺腺癌一代EGFR-TKI 耐藥細胞株呈現CSC表型具有干性，包括集落形成、增殖能力增強及干細胞標志物CD133 水平升高；此外，可能干細胞標志物Oct-4 通過調節具有EGFR 突變的非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）細胞系中的CSC特性來誘導吉非替尼耐藥。除此之外，某些蛋白的變化也會影響EGFR-TKI 耐藥性，F-盒/WD 重復蛋白7（FBXW7），與細胞靜止狀態有關，敲除FBXW7 基因可顯著減少肺癌吉非替尼耐藥細胞中CD133 陽性CSC 數量，從而提高吉非替尼的敏感性[15]。

1.2 ALDH

ALDH 是細胞內解毒酶的一個家族，能夠調節基因表達、細胞解毒和分化，并且在幾種腫瘤的耐藥性發展中具有重要作用，也是肺癌干細胞的重要標志物[16]。從NCI-H358 和NCI-H125 肺癌細胞株中分離出來的ALDH 陽性細胞富含致癌CD133 陽性的腫瘤細胞[17]。也有相關報道ALDH1 蛋白的高表達與NSCLC患者的預后差和化療藥物耐藥有關[18]。同樣，Huang等[16]探討了CSC 中ALDH1A1 表達與EGFR-TKI 耐藥性的關系，證明PC-9 肺癌細胞ALDH1A1 高表達對吉非替尼具有耐藥性。肺癌EGFR-TKIs 靶向治療還被證明可誘導ALDH 的過度表達、CSC 干性基因的增加（Nanog、Oct-4、Sox-2），并賦予其對EGFR-TKI治療的耐藥性[9]。近期發現全反式維甲酸通過影響干細胞標志物ALDH1 的活性抑制吉非替尼誘導的CSC的富集，從而進一步提高肺癌細胞毒性[19]。

1.3 ABC 轉運蛋白

ABC 轉運蛋白即ATP 結合式轉運蛋白，是一種能利用ATP 水解產生的能量對不同底物進行跨膜運輸的蛋白質。這種蛋白質一般位于細胞膜上，保護細胞免受有害毒素和異物的傷害[20]。ABC 轉運體包括ABCG2、ABCB1、ABCC1 等，其中ABCG2 轉運阿霉素、甲氨蝶呤等化療藥物，而ABCB1 在一半以上的化療耐藥腫瘤中都可見其表達[21-22]。并且有研究證實EGFRTKIs 與該轉運蛋白相互作用[23]。在肺癌患者的原發性腫瘤中，研究表明其過表達與NSCLC 中CSC 介導的耐藥性直接相關[24]。Chen 等[25]研究表明，在野生型EGFR 表達肺癌細胞中吉非替尼的耐藥性與ABCG2 的表達增加有關，并且與肺癌患者中吉非替尼的不良反應也有關。同樣阿法替尼耐藥的細胞系HCC827-ACR 也表現出ABCB1 的過表達，提示ABC 轉運蛋白與阿法替尼的獲得性耐藥密切相關[13]。因此，ABC蛋白作為CSC 的表面標記可以用來識別CSC，并且其本身轉運藥物的能力使得CSC 能夠對抗化療藥物的侵襲。

2 miRNA 調控肺癌干細胞干性介導EGFR-TKI 耐藥

miRNAs 是一類由內源基因編碼的長度為22～26個核苷酸的非編碼小分子RNA，參與轉錄后基因的表達調控。其異常表達、突變會導致蛋白水平表達異常，繼而通過影響相關的細胞信號通路改變腫瘤細胞對藥物的敏感性。研究發現，miRNA 與多種腫瘤耐藥相關，尤其是肺癌，并且可以影響腫瘤細胞對吉非替尼等藥物敏感性，參與EGFR-TKIs 耐藥[26]。此外，近年來研究表明，微RNA（miRNA）能夠通過調節轉錄因子和下游信號通路控制CSC 的生長和分裂，進而影響CSC 的自我更新與分化[27]。進一步研究顯示miRNA通過調控肺癌干細胞干性進而與肺癌EGFR-TKI 耐藥有關[27]。主要進展如下：

Wang 等[28]鑒定EGFR 突變晚期肺癌一代EGFRTKI 耐藥患者血漿中的miRNA 基因，發現一代EGFRTKI 治療下EGFR19 缺失的20 例NSCLC 患者中具有較高表達水平的miR-21、miR-34a 和miR-218。進一步發現，miR-223、miR-214 一起通過激活IGF1R/PI3K/AKT 和ERK 信號通路產生吉非替尼和厄洛替尼耐藥性[29-30]。EGFR-TKI 在NSCLC 中的更強功效歸因于miR-200c 過表達，這些患者能夠通過PI3K/AKT 和MEK/ERK途徑對EMT 的調節來恢復吉非替尼、厄洛替尼和阿法替尼的敏感性，且miR-200c 過表達與更高的疾病控制率，更長的無進展生存期和總生存期相關[13,31-32]。此外，大量證據證實miRNA 對CSC 干性的維持、自我更新及分化的調節至關重要[27]。進一步認為miRNA 可通過直接調節CSC 誘導的NSCLC進展和對耐藥的各個靶標而發揮重要的功能作用[27]。研究發現miR-124a 及miR-122 分別通過靶向泛素特異性蛋白酶14（USP14）及Prx Ⅱ過氧化物酶（Prxs）抑制肺癌干細胞的生長和自我更新，促進其凋亡進而增強吉非替尼敏感性[33-34]。研究發現miR-128 可以通過減少CSC 種群數來逆轉耐藥性并增強吉非替尼對NSCLC的抗腫瘤作用，并與c-met/PI3K/AKT 途徑有關[35]。同樣，研究發現miR-127 通過促進腫瘤細胞經歷EMT 過程并獲得肺癌干細胞自我更新及干性基因表達的上調，從而提高吉非替尼敏感性，這一特性與激活了Akt/ ERK 凋亡途徑相關[36]。進一步在非小細胞肺癌中發現，let-7 的下調和miR-17 的上調通過調節NSCLC 細胞的自我更新能力影響肺癌干細胞樣特征從而促進了對吉非替尼的耐藥[37]。綜上，miRNA 主要是通過控制相關信號通路的激活來實現對CSC 的調控，這使得CSC 能夠維持其干樣特性并對抗化療藥物的毒性作用。

3 植物化合物調控肺癌干細胞干性介導EGFR-TKI耐藥

目前一些研究表明，植物化合物可以有效抑制腫瘤細胞的增殖，誘導細胞凋亡，使腫瘤細胞增敏并增強治療功效[38]。進一步發現植物化合物通過調節肺癌干細胞干性進而與EGFR-TKI 耐藥有關，主要進展如下：

扶正解毒方藥，由黨參、黃芪、沙參等組成，研究發現CD133 陽性小鼠接種部位的腫瘤體積較普通肺癌細胞的腫瘤體積更大，且發生耐藥時間更短，然而在扶正解毒方藥治療下CD133 陽性小鼠接種部位的體積明顯更小，發生耐藥的時間最晚。暗示中藥能夠抑制肺癌干細胞的生長逆轉吉非替尼獲得耐藥[39]。具有抗癌能力的天然植物β-欖香烯，研究發現吉非替尼聯合欖香烯可抑制肺癌干細胞的干性包括自我更新能力，干性相關基因表達下降從而提高吉非替尼的敏感性，其與依賴EZH2 甲基轉移酶的致癌途徑有關[40]。BRM270 是從天然植物中提取的配方，由柑桔、蘆薈等組成。研究發現BRM270 誘導化學耐藥的NSCLC細胞凋亡從而抑制細胞增殖，進一步發現BRM270 能夠通過影響EMT 來抑制吉非替尼靶向耐藥的CSC，從而增強吉非替尼的敏感性[41]。硫磺酸存在于十字花類蔬菜中，已被證明能抑制各類癌細胞的惡性生長。用遞增濃度的硫磺酸聯合吉非替尼處理肺腺癌PC9耐藥細胞時發現，硫磺酸可顯著抑制肺癌干細胞標志物CD133 和CD44 的表達從而逆轉吉非替尼耐藥性，進一步發現，硫磺酸可能通過下調CSC 依賴的SHh途徑從而抑制肺癌干細胞干性增強吉非替尼的細胞毒性[42]。

4 小結與展望

綜上所述，可以發現這幾種分子機制的一個共同點就是對CSC 干樣特性維持的作用，這種作用是CSC 能夠對抗EGFR-TKI 類靶向藥物毒性作用的基礎。通過對CSC 耐藥機制的研究可以探索新的靶向目標，改善EGFR-TKI 向耐藥。例如，在EGFR-TKI靶向藥物的基礎上增加CSC 的靶向治療，通過這種聯合治療方案能夠同時清除腫瘤細胞和CSC，提高腫瘤患者靶向治療的整體效果，具有很好的前景。盡管CSC 在耐藥性中的作用是一個熱門且新興的話題，但目前其尚缺乏深入的臨床應用。未來對腫瘤和CSC生物學的更深入了解將促進對腫瘤進程和對靶向治療耐藥的新的機制的理解，隨著這一高度活躍領域的發展，NSCLC 患者的臨床結局有望得到改善。