CAR-T療法在肝癌中的研究進展

葛震，吳遠博，毛琦淇，李宏

作者單位：315211寧波，寧波大學醫學院（葛震、吳遠博）；寧波市醫療中心李惠利醫院（毛琦淇、李宏）

近年來，嵌合抗原受體T細胞（CAR-T）療法發展迅速，特別是在血液惡性腫瘤的治療中。CAR-T指將患者自身外周血中T細胞分離出來并采集，然后將可與腫瘤相關抗原（TAA）識別的單鏈抗體片段（scFv）通過病毒等載體轉導至T細胞并利用MLV逆轉錄病毒和piggy Bac轉座子等特殊的載體設計將其整合于細胞內基因組中，使T細胞表面表達嵌合抗原受（CAR）。CAR-T細胞與TAA識別并結合后，誘導了構象變化，通過TCR/CD3的 鏈或Fc RI的 鏈向T細胞傳遞活化信號和共刺激信號，導致細胞因子釋放和轉錄因子表達，最終引起對腫瘤細胞的細胞毒性反應[1]。本文針對目前CAR-T在肝癌中的應用現況，討論了目前的障礙和可能的解決方案，并描述了提高CAR-T細胞對HCC患者療效的潛在策略。

1 CAR-T的發展歷程

CAR主要由胞外區、跨膜區和胞內區組成。胞外區主要是由能以非MHC限制性的方式直接識別TAA的單克隆抗體輕鏈、重鏈可變區序列（scFv）（如CD19sc Fv、CD33sc Fv等）和鉸鏈組成，連接到跨膜結構域上；跨膜區主要是I型二聚體跨膜蛋白，如CD4、CD8、CD28[2]。胞內區是免疫受體酪氨酸活化基序（ITAM），通常是TCR/CD3和Fc RI，當胞外區與TAA結合后，向T細胞傳遞活化信號和共刺激信號。

數年來，CAR分子結構不斷優化，到目前為止，CAR分子已經發展到了第四代。第一代的CAR只含有一個胞內信號激活受體CD3，由于缺少共刺激分子，不能轉導增殖信號和誘導細胞因子產生，無法有效地實現CAR-T細胞在體內的持續的增殖。第二代CAR細胞內增加了一個共刺激分子，如CD28、CD27、41BB（CD137）、OX40（CD134）或者可誘導共刺激分子（ICOS），即便沒有外源性共刺激分子，T細胞也能持續增殖并釋放細胞因子。Milone等[3]使用二代CAR-T細胞在急性前B-淋巴細胞白血病小鼠體內進行實驗，發現擁有共刺激分子的二代CAR-T細胞能持續增殖且活性增強。相比于二代CAR-T細胞，三代細胞內加入了兩個共刺激分子，進一步增強細胞因子的分泌并抑制腫瘤生長。第四代CAR分子在二、三代分子結構的基礎上整合表達免疫因子或共刺激因子配體（如IL-12），一旦與靶抗原結合，激活下游轉錄因子（NFAT）來誘導表達IL-12，從而招募環境中的其他免疫細胞，參與對不表達靶抗原的腫瘤細胞的清除；同時，被募集在腫瘤附近的免疫細胞還可以通過分泌某些細胞因子（如IFN-、TNF-、IL-4和IL-5等）來調節腫瘤附近的微環境，解除其免疫抑制性，通過調動機體自身免疫力參與對腫瘤細胞的殺傷作用[4]。

CAR-T細胞療法在血液系統腫瘤中的應用取得了驚人的療效，特別是特異性靶向CD19分子的CAR-T（CD19-CAR-T）細胞。臨床研究表明其對晚期復發難治性淋巴細胞白血病（ALL）的治療有效率可達到90%，對慢性淋巴細胞白血病（CLL）和部分B細胞淋巴瘤的有效率＞50%[5]。2017年8月30日，美國食品藥品監督管理局（FDA）批準了美國諾華公司用于治療血液系統腫瘤的CAR-T療法藥物Kymriah，這一藥物的上市，激發了研究者對CAR-T治療拓展應用于實體瘤的研究熱情。

2 CAR-T細胞治療肝癌的靶點

2.1 Glypican-3（GPC3）GPC3是硫酸乙酰肝素蛋白聚糖家族的成員，可能在細胞分裂控制和生長調節中發揮重要作用。腫瘤細胞中更高的GPC3表達與肝癌預后較差有關。GPC3在HCC和其他腫瘤類型中高表達，同時在正常組織中無法檢測到它[6]。

Zhu等[7]在晚期HCC患者中使用GC33（一項選擇性靶向GPC3的重組完全人源化單克隆抗體），表明GC33對GPC3高表達組具有抗腫瘤活性，且在所有劑量水平上，GC33都具有良好的耐受性，為選擇性靶向GPC3提供了依據。Jiang等[8]將GPC3-CAR-T細胞移植到患者來源的三組HCC異種移植（PDX）模型中，評價了體內GPC3-CAR-T細胞的細胞毒性。結果表明GPC3-CAR-T細胞消除了PDX1組和PDX2組中的腫瘤細胞且有效抑制了PDX3組中的腫瘤生長，證明GPC3-CAR-T細胞能夠有效地抑制體內原發性GPC3+HCC的生長。Shi等[9]進行了兩項前瞻性I期研究，讓患有晚期GPC3+HCC的成年患者（Child-Pugh A級）接受自體GPC3-CAR-T細胞療法，13例患者的中位OS為278天。研究還進行了不良反應的評估，9例患者中觀察到細胞因子釋放綜合征（CRS），其中8名受試者發生了自限性的低級CRS（1級或2級），沒有患者發生3/4級神經毒性和CAR-T細胞相關的輸注反應，證明GPC3-CAR-T細胞臨床安全性較高。也有研究表明，抗GPC3和EGFR雙靶向CAR-T細胞在體外對GPC3+EGFR+HCC細胞產生細胞毒性，而且其產生的細胞因子較單靶向T細胞更強，同時在體內抑制腫瘤增殖也較抗GPC3-CAR-T細胞更強，為抗GPC3-CAR-T細胞聯合其他靶向研制藥物提供依據[10]。

2.2 甲胎蛋白（AFP）AFP具有一系列重要的生理功能，包括轉運功能、免疫抑制、誘導凋亡等[11]。胎兒的血清AFP濃度很高，但成人很低。然而，當成人發生肝細胞癌、肝母細胞瘤和畸胎瘤時，AFP會重新表達，因此可作為腫瘤診斷和療效監測的血清標志物。傳統的CAR-T細胞只能識別腫瘤表面抗原，而不能識別細胞內或分泌的抗原。考慮到所有細胞內或分泌的蛋白質都被加工成肽，并由腫瘤細胞表面的I類MHCs呈遞，Liu等[12]構建的AFP-CAR-T細胞可以選擇性地與HLA-A*02∶01呈遞的AFP 158-166肽結合，然后脫顆粒，釋放細胞因子，裂解HLA-a*02∶01+/AFP+腫瘤細胞。此外，在HCC異種移植模型和播散性腹膜肝癌模型中，發現AFP-CAR-T細胞能夠成功抑制腫瘤的生長。與此同時，他們進行了一項I期臨床試驗，成功評估了表達AFP的HCC患者體內CART細胞的安全性和有效性（NCT03349255）。因此，用CAR-T細胞靶向細胞內和分泌的腫瘤抗原產物是有希望的癌癥治療策略。

2.3 CD147 研究表明CD147促進了HCC細胞的增殖、侵襲和轉移，并有潛力用作腫瘤的重要預后和治療生物標志物。目前已開發碘-131標記的CD147特異性單克隆抗體，可顯著延長腫瘤復發中位時間[13]。因此針對CD147的靶向治療可能為HCC提供一種有效的治療策略。

Zhang等[14]開發出一種由Tet-On系統控制的經修飾的新型誘導型CAR-T細胞，能夠在存在或去除多西環素（Dox）時可逆地開啟或關閉CAR基因表達。當發生嚴重不良事件時，可以立即終止Dox的供應，在這種情況下，T細胞上CD147-CAR的表達將在24～48h內恢復到基線水平。在體外實驗中，（Dox+）Tet-CD147-CAR-T細胞與（Dox－）Tet-CD147-CAR-T細胞和外周血單個核細胞相比，表現出更高的細胞毒性和增加的細胞因子分泌；同時，Tet-CD147-CART細胞對HCC細胞顯示出顯著的細胞毒性，還可以釋放多種免疫刺激性細胞因子來增強抗腫瘤作用。進一步他們在體內進行了Tet-CD147-CART細胞抗腫瘤活性的實驗，結果表明在有DOX存在時，CD147-CART細胞可以有效殺死癌細胞的HCC異種移植物模型。提示CD147-CAR-T細胞可能可以為肝癌患者臨床藥物提供治療選擇。

2.4 CD133 CD133是在各種實體瘤中過表達的五聚糖跨膜糖蛋白，在50%的HCC高表達。Kohg等[15]報道稱，CD133細胞只存在于肝癌組織中，而不存在于非癌肝組織中，并且CD133在肝癌細胞中的表達可能誘導肝癌細胞的生長和轉移，CD133的高表達通常與較高階段的癌癥等級、較差的患者預后相關聯。此外，CD133已被證實是參與癌癥干細胞和內皮祖細胞腫瘤轉移和復發的標志物[16]。在一項I期臨床試驗中，接受CD133-CAR-T治療的HCC患者中位生存期為7個月，明顯高于一線治療無效的晚期HCC患者（4個月）。CD133-CAR-T重復輸注后，可使無法對一線治療產生反應的患者獲得相對較長的穩定期，同時通過重復注射能夠有效改善CAR-T細胞治療的持久性，使CD133-CAR-T細胞可以在體內長期生存，而CAR基因的持久性也可以有效實現疾病清除和防止復發的作用。在II期臨床試驗中，CD133-CAR-T細胞在晚期HCC中具有較好的抗腫瘤活性和可控的安全性。該研究結果表明總生存期的中位數為12個月，無進展生存期的中位數為6.8個月[17]。

2.5 c-Met c-Met是一種由MET原癌基因編碼的酪氨酸激酶受體，它具有高親和力配體-肝細胞生長因子（HGF）。HGF誘導c-Met二聚化激活，從而刺激多個下游信號通路，包括促分裂原激活的蛋白激酶、磷酸肌醇3-激酶以及核因子kappa-B，導致一系列生物學效應，如細胞生長、增殖、侵襲及遷移等[18]。c-Met/HGF信號抑制劑能減少肝細胞腫瘤細胞的增殖，細胞運動性和侵襲性，并促進凋亡，已在HCC臨床前模型中顯示出抗腫瘤潛力，c-Met抑制劑在HCC的治療中也顯示出療效，尤其是對c-Met陽性腫瘤的治療。同時，臨床及臨床前試驗已有部分非選擇性c-Met抑制劑來治療HCC[19]。因此c-Met被認為是治療HCC的一個潛在靶點。

Liu等[20]研究c-Met-CARNK細胞在體內表現出對人肝癌HepG2細胞具有細胞毒性作用。近期研究也表明，雙特異性c-Met/PD-L1 CAR-T細胞可以通過在體外對HCC細胞顯示出優異的細胞裂解能力，產生更多殺傷HCC細胞的細胞因子和更加顯著的抑制小鼠體內HepG2異種移植物的腫瘤生長[21]。

2.6 PD-1 程序性死亡受體1（PD-1），也稱為CD279，是一種重要的免疫抑制分子。通過下調免疫系統對人體細胞的反應，以及通過抑制T細胞炎癥活動來調節免疫系統并促進自身耐受[22]。在腫瘤的發展和生長過程中，肝微環境中有效的抗腫瘤免疫監視受到損害，而PD-1/PD-L1信號通路，參與了上述過程[23]。在HCC患者中，PD-1在CD8+T細胞中的表達增加；此外，在肝癌患者中高表達PD-1與腫瘤浸潤淋巴細胞和衰竭表型相關。2017年9月，Nivolumab被FDA批準用于在索拉非尼失敗后的肝癌二線治療的抗PD-1單克隆抗體。盡管部分患者的臨床結局有所改善，但抗PD-1/PD-L1抑制劑在80%的HCC患者中仍然無效。此外，它們價格昂貴并且引起許多嚴重的副作用[24]。因此，針對PD-1為靶點的藥物茲待開發。

Pan等[25]研制出攜帶PD-1-CH3融合蛋白（sPD1）的GPC3特異性CAR-T細胞，并證實其可以特異性識別、裂解的GPC3陽性HCC細胞，同時在體內實驗中顯示出比GPC3-CAR-T細胞更高的腫瘤抑制能力。與此同時，GPC3-28Z-sPD1 T細胞治療的小鼠中觀察到腫瘤中CD3陽性T細胞的數量增加，顆粒酶B水平升高和Ki67表達水平降低。這些數據共同表明，攜帶sPD1的GPC3特異性CART細胞顯示出有望用于治療HCC患者。近期研究表明，PD-1的破壞增強了CART細胞對肝癌的體內抗腫瘤活性，改善了帶有腫瘤的小鼠中CAR-T細胞的持久性和浸潤性，并增強了GPC3-CAR-T細胞在異種移植腫瘤中對腫瘤相關蛋白基因表達的抑制作用，也顯示出PD-1對CAR-T細胞中的應用有巨大作用[26]。

3 CAR-T細胞治療肝癌所面臨的困難及策略

3.1 腫瘤特異性抗原的缺乏 CAR-T細胞治療HCC成功的障礙之一是難以找到理想的腫瘤相關抗原（TAA）。盡管針對HCC的靶點有很多，例如AFP、CD147及GPC3等，但其特異性不強。此外，由于腫瘤組織異質性這一特點導致不同轉移部位的腫瘤即使亞型相同遺傳類型也不同，造成了CAR-T療效不佳。由于這些靶點的表達不同，單一的CAR-T治療策略可能并不適用于所有HCC患者。此外，TAA不僅在癌細胞中表達，而且在正常細胞中也以低水平表達，因此在健康組織中引起靶向、腫瘤外毒性。目前，T細胞工程中主要應用了3種類型的雙特異性CAR，即雙靶CAR、串聯CAR和通用CAR。通過使用兩個或多個細胞外抗原識別基序設計特異性更強的CAR-T細胞來增強CAR-T結合實體瘤靶點的有效性。Kloss等[27]首先報道了一種帶有嵌合共刺激受體（CCR）的次優CAR細胞（前列腺特異性膜抗原PSMA和前列腺干細胞抗原PSCA），只有當這兩種靶抗原同時出現在腫瘤細胞表面時，雙T細胞才會被完全激活，并殺死了表達這兩種抗原的細胞，從而顯著增強特異性，使正常細胞不受影響。

3.2 T細胞活性維持時間短 CAR-T在各種實體瘤患者體內的活化維持時間從22d到9個月不等[28]，維持時間短，影響患者預后。選用特定亞型的T細胞用于編輯CAR-T細胞，如幼稚性T細胞（表達CD62L），與效應T細胞相比，此種CAR-T細胞具有更強的在患者體內持續存在的能力[29]。

另一種用于延長CAR-T在體內的活化時間的方法是通過敲除T細胞內的特定基因。鋅指（TALEN）技術被用來永久性地刪除T細胞中TCRa和b的表達[30]。這些T細胞通過CAR而非TCR定向刺激對CD19抗原產生應答，這表明同種異體的CAR-T細胞并不會產生移植物抗宿主病，這是向產生通用供體T細胞方向邁出的重要一步。因此，無論供體來源如何，都有可能產生具有最佳移植效果的T細胞庫，從而規避個性化患者產品固有的可變性。

3.3 CAR-T細胞歸巢 CAR-T細胞向腫瘤部位高效遷移從而直接與腫瘤細胞結合是CAR-T細胞療法成功的關鍵。趨化因子在淋巴細胞遷移中起主要作用，如CXCR2、CXCR3和CCR5。因此，可將腫瘤組織高表達的趨化因子相應受體整合于CAR-T細胞中作為靶點。這種方法最初是通過趨化因子受體CXCR2在T細胞中的表達來證明的，CXCR2對黑色素瘤腫瘤細胞產生的趨化因子CXCL1（Groa）具有特異性[31]。Moon等[32]運用痘苗病毒在小鼠間皮瘤模型中瘤內遞送趨化因子CXCL11時，發現CAR-T浸潤水平和抗腫瘤效果顯著增加。Smith等[33]研究表明與全身給藥相比，局部注射需要的細胞數量更少、毒性反應更低。趨化因子系統是復雜的，因此，為了有效靶向CAR-T細胞，需要了解腫瘤產生的一系列趨化因子的組合效應，以制定一種策略，專注于重要的歸巢趨化因子，避免其他腫瘤表達的趨化因子的潛在調控作用。

3.4 腫瘤微環境的免疫抑制 腫瘤微環境具有氧化應激、營養耗竭、酸性pH環境和缺氧等特性，可降低CAR-T細胞活性。Juillerat等[34]發現共表達缺氧誘導因子的CAR-T細胞可在腫瘤微環境中獲得更強的活性，在體外正常氧水平下該種CAR表達低下，但在低氧條件下CAR表達水平顯著提高。IL-12的產生與CAR活性密切相關，共表達IL-12的CAR-T細胞能保證IL-12在腫瘤微環境中局部產生，影響了腫瘤基質內的局部抑制細胞，誘導了巨噬細胞活性，導致對癌癥的免疫攻擊范圍擴大，包括對CAR靶抗原表達缺失的腫瘤細胞的攻擊[35]。

3.5 不良反應 CAR-T細胞治療過程中產生的嚴重不良反應也是應用于實體腫瘤的主要挑戰，例如急性呼吸窘迫綜合征、CRS及嚴重神經毒性（SNT）等。CAR-T細胞治療的毒性增加主要有兩種機制：（1）CAR-T細胞免疫治療后最危及生命的毒性是靶向毒性，如CRS。CART細胞與靶腫瘤細胞上的抗原結合后被廣泛激活，導致大量炎性細胞因子的釋放。CRS癥狀包括發燒、疲勞、惡心、嘔吐、腹瀉、皮疹、譫妄、幻覺及低血壓，甚至嚴重的多器官衰竭。其嚴重程度與腫瘤負荷密切相關。IL-6似乎是CRS的主要調節因子，因此改善這一副作用的關鍵策略是直接用IL-6R抑制劑tocilizumab阻斷IL-6；（2）另一種類型的毒性來自CART細胞與正常細胞的靶抗原結合，導致健康細胞和器官的破壞。例如，在神經母細胞瘤的治療中，GD2特異性CAR-T細胞治療存在致命的神經毒性，提示GD2可能是CAR-T細胞治療的不合適的靶向抗原。為了降低這種毒性的風險，提高CAR-T細胞靶抗原特異性顯得尤為重要，如上文中提及的雙靶CAR-T細胞。

4 總結與展望

盡管CAR-T細胞治療血液系統惡性腫瘤取得了令人印象深刻的成果，但想要實現實體瘤的可靠治愈，CAR-T細胞的研究和應用要還有很長的路要走，尤其是HCC。如本文所提許多有希望的針對HCC的CAR-T細胞治療策略已經在臨床前模型中實施，并顯示出有希望的結果。CAR-T在臨床前和臨床研究中均被證明是一種有前途的HCC治療方法。進一步優化CAR的設計，以提供更好的T細胞活化、識別特異性、抗腫瘤活性和安全性控制。尋找最佳信號和共刺激域繼續提高CAR-T治療的療效。應用雙靶CAR提高腫瘤細胞識別特異性，限制對正常細胞的意外攻擊。克服免疫抑制腫瘤微環境，對CAR修飾的T細胞進行更多的修飾（IL12、PD1、CTLA4）。建立標準的臨床方案，包括患者預處理、細胞因子支持和其他潛在的聯合治療。隨著這些技術難題的不斷突破，相信CAR-T將會在實體瘤的治療中獲得更好的效果。