動(dòng)物源性食品中抗生素殘留的快速檢測(cè)方法研究

◎ 趙 瓊，劉學(xué)明

（1.定西市食品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，甘肅 定西 743000；2.渭源縣食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，甘肅 渭源 748200）

抗生素是指由細(xì)菌或真菌等微生物在生長(zhǎng)過(guò)程中形成的一類(lèi)次級(jí)代謝產(chǎn)物，能夠使禽畜免受疾病的影響，有利于其健康成長(zhǎng)。然而抗生素的濫用會(huì)導(dǎo)致禽畜體內(nèi)藥物殘留超標(biāo)，人們食用了這類(lèi)動(dòng)物源性食品后，可能會(huì)出現(xiàn)體內(nèi)菌群失衡，甚至危及生命。

1 動(dòng)物源性食品中抗生素殘留的種類(lèi)

1.1 β-內(nèi)酰胺類(lèi)

β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素指的是帶有β-內(nèi)酰胺環(huán)結(jié)構(gòu)的藥物，此類(lèi)藥物殺菌活性很強(qiáng)，且毒性較低，在臨床與獸藥方面應(yīng)用廣泛。β-內(nèi)酰胺類(lèi)藥物在疾病防治方面的不合理應(yīng)用，將會(huì)導(dǎo)致很多肉蛋食品內(nèi)出現(xiàn)抗生素殘留，從而引發(fā)人體過(guò)敏，或腸道菌群失衡[1-3]。

1.2 大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)

大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)是一種弱堿性的親酯性抗生素，由大環(huán)內(nèi)酯基團(tuán)與糖衍生物經(jīng)過(guò)化學(xué)反應(yīng)形成，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和動(dòng)物支原體有著良好的抗菌效果。目前大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素主要用于水產(chǎn)養(yǎng)殖和禽畜養(yǎng)殖行業(yè)，主要治療動(dòng)物呼吸道疾病與腸道傳染性疾病。

1.3 氨基糖苷類(lèi)

氨基糖苷類(lèi)抗生素起源于1944年的鏈霉素，主要有天然與半合成兩種。天然氨基糖苷類(lèi)抗生素來(lái)源于鏈霉菌屬培養(yǎng)液提取的新霉素和卡那霉素，半合成的抗生素常見(jiàn)的有阿米卡星和奈替米星。由于氨基糖苷類(lèi)抗生素價(jià)格低廉且使用高效，目前已經(jīng)被廣泛用在動(dòng)物疾病的防治中，也在水產(chǎn)行業(yè)中作抗菌藥使用。

1.4 四環(huán)素類(lèi)

四環(huán)素類(lèi)抗生素主要從鏈霉菌培養(yǎng)液內(nèi)提取，低廉的價(jià)格使其被廣泛應(yīng)用，不僅用于疾病治療，也可被作為添加劑使用，提高了飼料的使用率。但是若濫用四環(huán)素類(lèi)抗生素，會(huì)使細(xì)菌的耐藥性顯著提升，目前在土壤、地表水、地下水中均有被檢出。

2 動(dòng)物源性食品中抗生素殘留的前處理技術(shù)

2.1 液-液萃取

樣品的前處理是動(dòng)物源性食品抗生素檢測(cè)的技術(shù)核心，會(huì)對(duì)技術(shù)指標(biāo)產(chǎn)生直接影響。液-液萃取根據(jù)分析物在不同溶劑中的分配系數(shù)不同，經(jīng)過(guò)勻漿、萃取、凈化及富集等步驟達(dá)到樣品分離目的。常使用的溶劑有乙酸乙酯和二氯丙烷，該前處理技術(shù)的應(yīng)用對(duì)實(shí)驗(yàn)條件要求不高，但操作時(shí)間比較長(zhǎng)，目前多用于四環(huán)素類(lèi)抗生素殘留的處理與檢測(cè)[4-5]。

2.2 固相萃取

固相萃取主要是應(yīng)用固體吸附劑將液體樣品目標(biāo)化合吸附，同樣品基質(zhì)分離后，使用加熱解吸附和分離等方式達(dá)到處理目標(biāo)。常使用的固相萃取主要有氧化鋁和硅膠，無(wú)需使用大量溶劑，且處理時(shí)不會(huì)出現(xiàn)乳化現(xiàn)象，可以有效提高樣品前處理的效率，節(jié)約試驗(yàn)成本。

2.3 基質(zhì)輔助固相分散萃取

基質(zhì)輔助固相分散萃取就是將涂抹了C18等聚合物的單體固相萃取材料，同樣品研磨，研磨之后得到處于半干狀態(tài)的混合物，再將混合物填料裝柱，使用不同溶劑來(lái)淋洗柱子，直到待測(cè)物洗脫下來(lái)?；|(zhì)輔助固相分散萃取方法屬于一種高效便捷的前處理方法，不僅樣品與有機(jī)溶劑用量少，且萃取速度快，目前已被用于食品、飼料、藥品的殘留分析。

3 動(dòng)物源性食品中抗生素殘留的快速檢測(cè)手段

3.1 微生物檢測(cè)法

采用微生物檢測(cè)法進(jìn)行動(dòng)物源性食品的抗生素檢測(cè)，整個(gè)檢測(cè)工作需要處于適宜的條件下，通過(guò)分析抗生素對(duì)微生物的抑制作用，計(jì)算抗生素的活性情況。微生物檢測(cè)方法的應(yīng)用需要大量平板，所以實(shí)驗(yàn)過(guò)程與步驟會(huì)十分煩瑣，該方法價(jià)格低廉，目前在抗生素檢測(cè)中廣泛應(yīng)用。常用到的微生物檢測(cè)法主要有紙片法和擴(kuò)散法，適用于大批量動(dòng)物源性食品樣品檢測(cè)。

3.2 免疫檢測(cè)法

3.2.1 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法

免疫檢測(cè)法就是通過(guò)對(duì)抗體抗原的研究而采用的快速檢測(cè)技術(shù)，依靠抗原抗體間的特異與可逆結(jié)合特性，對(duì)動(dòng)物源性食品中的抗生素含量進(jìn)行檢測(cè)，這種方法簡(jiǎn)單快捷，成本更低。酶聯(lián)免疫法綜合利用抗原抗體特異性和酶對(duì)底物的催化性，使樣品內(nèi)的抗生素與抗原抗體結(jié)合，再加入底物，依靠酶的作用使抗生素顯色，按照顏色的深淺確定抗生素在樣品中的實(shí)際含量。酶聯(lián)免疫法主要有直接法與間接法，還有雙抗夾心法，市面上的酶聯(lián)免疫試劑盒多數(shù)是通過(guò)直接法得到的，該方法可以在2 h內(nèi)處理100個(gè)樣品，高效便捷，處理效果更快。國(guó)外利用該方法與激光探測(cè)技術(shù)相結(jié)合，創(chuàng)建了抗生素快速檢測(cè)系統(tǒng)，系統(tǒng)在9 min以?xún)?nèi)就能檢測(cè)出牛奶的抗生素殘留量，并準(zhǔn)確辨認(rèn)具體的抗生素種類(lèi)。

隨著技術(shù)的不斷改進(jìn)，核酸適配體逐漸取代了抗體，能夠檢測(cè)更多種類(lèi)的物質(zhì)，且檢測(cè)效果更加穩(wěn)定，具有無(wú)免疫原性的優(yōu)勢(shì)。采用適配體競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)定蜂蜜內(nèi)的抗生素殘留，依靠適配體的間接競(jìng)爭(zhēng)測(cè)量出四環(huán)素含量，線(xiàn)性范圍在0.01～100.00 ng·mL-1。此外也有研究人員利用分子印跡聚合物進(jìn)行抗生素測(cè)量，該方法成本低、化學(xué)穩(wěn)定性較強(qiáng)，且易保存，將分子印跡聚合物作為偽生抗體，通過(guò)直接競(jìng)爭(zhēng)的免疫檢測(cè)法檢測(cè)牛肉中的恩諾沙星殘留含量，檢出限為1.1 ng·mL-1。

3.2.2 膠體金免疫層析技術(shù)

膠體金免疫層析技術(shù)與免疫分析技術(shù)、膠體金標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合，使抗生素檢測(cè)更加快速便捷，且靈敏度更高。當(dāng)前市面上已經(jīng)有很多抗生素檢測(cè)的膠體金試紙條，待測(cè)物在毛細(xì)作用下經(jīng)過(guò)層析膜上的T線(xiàn)與C線(xiàn)時(shí)，同上面的特異性抗原抗體相結(jié)合，查看T線(xiàn)與C線(xiàn)的顏色變化情況，可完成對(duì)樣品的檢測(cè)。使用該方法檢測(cè)奶粉中的林可霉素時(shí)，樣品不需要進(jìn)行前處理，利用膠體金試紙條后，在10 min內(nèi)就能得出檢測(cè)結(jié)果，也有研究人員制備了氟喹諾酮膠體金檢測(cè)試紙，5 min內(nèi)就檢測(cè)出了牛奶乳品內(nèi)的9種抗生素，檢出限可以達(dá)到 20 μg·L-1。

3.3 氣相色譜檢測(cè)法與離子交換色譜法

采用氣相色譜檢測(cè)法與離子交換色譜法進(jìn)行動(dòng)物源性食品抗生素殘留的檢測(cè)較少，但在某種特定要求下也會(huì)用到。例如采用氣相色譜法檢測(cè)乳制品內(nèi)的抗生素殘留，或檢測(cè)食品中的氯霉素殘留；應(yīng)用離子交換色譜法測(cè)定沒(méi)有經(jīng)過(guò)紫外線(xiàn)吸收的抗生素，如大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素。應(yīng)用混合型離子交換液綜合色譜與質(zhì)譜檢測(cè)方法檢測(cè)蜂蜜內(nèi)的抗生素殘留，這種方法在檢測(cè)時(shí)無(wú)需添加離子對(duì)試劑，避免對(duì)質(zhì)譜儀造成污染，且試劑的靈敏度較高。

3.4 高效液相色譜檢測(cè)法

高效液相色譜檢測(cè)法是目前國(guó)內(nèi)用于藥物殘留檢測(cè)最普遍的方法，不僅靈敏度高，且檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定，檢測(cè)限更低。應(yīng)用反相色譜法時(shí)，需要用到紫外檢測(cè)設(shè)備與熒光檢測(cè)設(shè)備，檢測(cè)牛奶與肉制品內(nèi)的青霉素、氯唑西林等抗生素殘留時(shí)，可以使用高效液相色譜檢測(cè)方法。利用固相萃取法將抗生素殘留富集在一起，使其在色譜柱上洗脫，在210 nm波長(zhǎng)條件下，10 min以?xún)?nèi)即可檢測(cè)出雞肉樣品內(nèi)的金霉素殘留。融合固相萃取、液相色譜及光電二極管檢測(cè)器，分析食品內(nèi)的痕量物質(zhì)情況，或檢測(cè)水體中的抗生素殘留，檢測(cè)方法高效靈敏。

3.5 色譜聯(lián)用技術(shù)

依據(jù)對(duì)獸藥殘留分析特點(diǎn)，使用色譜聯(lián)用技術(shù)，將定量與定性融為一體，適用于對(duì)青霉素和氨基糖苷類(lèi)抗生素的確證性分析，其靈敏度比熒光檢測(cè)器高出1個(gè)數(shù)量級(jí)，可以準(zhǔn)確檢測(cè)出納克級(jí)的抗生素殘留。采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法，測(cè)定動(dòng)物源性食品內(nèi)的氯霉素和四環(huán)素類(lèi)抗生素，或應(yīng)用全自動(dòng)固相萃取-液相色譜檢測(cè)方法測(cè)定動(dòng)物源性食品中的β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素，這類(lèi)抗生素在此實(shí)驗(yàn)條件下具有線(xiàn)性關(guān)系，且靈敏度也能夠滿(mǎn)足檢測(cè)要求。采用色譜聯(lián)用技術(shù)檢測(cè)牛肉內(nèi)的抗生素殘留，檢測(cè)效果較好。

3.6 光譜檢測(cè)技術(shù)

表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)作為光譜檢測(cè)技術(shù)的一種，主要利用光被分子散射之后形成的頻率變化得出關(guān)于分子振動(dòng)的信息，并確定分子結(jié)構(gòu)類(lèi)型。拉曼光譜的散射面比較小，因此信號(hào)較弱，檢測(cè)靈敏度普遍不高。表面增強(qiáng)拉曼光譜經(jīng)過(guò)表面粗糙的納米金屬材料，增強(qiáng)吸附在材料表面的拉曼信號(hào)，彌補(bǔ)以往拉曼信號(hào)的不足。應(yīng)用該方法檢測(cè)動(dòng)物源性食品內(nèi)的抗生素殘留，檢測(cè)之前無(wú)需對(duì)食品樣品進(jìn)行前處理，可以免去對(duì)樣品的制備過(guò)程，減少測(cè)定時(shí)間，目前主要用于檢測(cè)動(dòng)物源性食品中的氯霉素和環(huán)丙沙星類(lèi)抗生素，檢出限可以達(dá)到 20 μg·mL-1。

除此以外，還可以使用近紅外光譜技術(shù)完成抗生素檢測(cè)，通過(guò)對(duì)樣品近紅外光譜的掃描，得出樣品不同基團(tuán)吸收波長(zhǎng)情況，再將其與模型比較研究，得出化合物結(jié)構(gòu)信息。對(duì)動(dòng)物源性食品樣品可以直接測(cè)量，不需要前處理，也不需要使用化學(xué)試劑，得出的近紅外光譜是動(dòng)物源性食品樣品所有組分的近紅外吸收總和。為了避免其他組分對(duì)待測(cè)抗生素組分產(chǎn)生干擾，測(cè)定動(dòng)物源性食品樣品時(shí)，建議將其與化學(xué)計(jì)量學(xué)相結(jié)合，可有效測(cè)定青霉素與克拉維酸抗生素。

4 結(jié)語(yǔ)

用于動(dòng)物源性食品內(nèi)的抗生素殘留檢測(cè)方法有很多，常用到的免疫檢測(cè)法、生物檢測(cè)法操作簡(jiǎn)單、靈敏度較高。應(yīng)依據(jù)抗生素的種類(lèi)，結(jié)合不同快速檢測(cè)技術(shù)的適用情況，有效監(jiān)控動(dòng)物源性食品內(nèi)的抗生素含量。經(jīng)過(guò)分析得知，色譜聯(lián)用技術(shù)與固相萃取是目前使用效果較好的抗生素檢測(cè)方法與樣品前處理方法，儀器的小型化將成為未來(lái)檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展趨勢(shì)。