克羅諾桿菌屬快速檢測技術的研究進展

◎ 林 杰

（廈門市產品質量監督檢驗院，福建 廈門 361004）

克羅諾桿菌是一種危險性極高的致病菌。有研究表明，嬰幼兒奶粉、奶酪、腌肉、飲用水和蔬菜等多種日常食品中均可能檢測出此種致病菌[1]。在一些新生兒克羅諾桿菌感染事件的調查結果中，這些受感染的新生兒都是食用了嬰幼兒奶粉后才出現了相關癥狀，經檢測確定為克羅諾桿菌感染。近年來，隨著一系列與此種病菌相關的奶粉召回以及其他重大事件的爆發，克羅諾桿菌污染問題已經受到了全世界的廣泛關注。基于此，探討如何快速完成對食品中是否含有克羅諾桿菌檢測的必要性。

1 克羅諾桿菌

克羅諾桿菌原名阪崎腸桿菌，在人和動物的腸道內生活，屬于兼性厭氧革蘭氏陰性桿菌，隸屬于腸桿菌科。克羅諾桿菌是一種致病劑量較低的食源性致病菌，廣泛存在于嬰幼兒奶粉、肉類、飲用水和蔬菜中。寄生在人和動物的腸道之后（是一種有周生鞭毛，能運動的無芽孢桿菌），可引起菌血癥、腦膜炎、壞死性小腸結腸炎等疾病。近年來發生的多起克羅諾桿菌感染事件表明，嬰幼兒是該菌感染的高危人群，一旦引發相關疾病，致死率最高可達80%。目前，已經探明的克羅諾桿菌共有7個菌種，分別為阪崎克羅諾桿菌、丙二酸鹽克羅諾桿菌、蘇黎世克羅諾桿菌、莫金斯克羅諾桿菌、康帝蒙提克羅諾桿菌、尤尼沃斯克羅諾桿菌和都柏林克羅諾桿菌（可進一步分為都柏林亞種、奶粉亞種、洛桑亞種）。

目前，世界各國已經從分類、分型、檢測、生化特性、致病性和污染源等方面對克羅諾桿菌進行研究，結果表明，與其他食源性致病菌相比，該菌對絕大多數人都不存在致病性，即使攝入人體內，也能夠在腸道內與其他菌群“和諧相處”。但對包含嬰幼兒在內的一些特定人群，克羅諾桿菌的致病率和致死率卻較高，而目前學界尚未探明克羅諾桿菌因何原因致特定人群感染嚴重疾病。基于此，只能采取“一刀切”政策，即對各類可能與人類、動物（主要是家養寵物、養殖牲畜、家禽等）密切接觸的物品進行檢測時，將克羅諾桿菌作為一項重點檢測內容。

2 基于分子生物學的快速檢測技術

2.1 聚合酶鏈式反應技術

聚合酶鏈式反應技術英文全稱Polymerase Chain Reaction，簡稱PCR，可被視為“生物體外特殊DNA復制”。此種鏈式反應的過程如下。①將一種物質的DNA自生物體內取出，放置于95 ℃的高溫環境下，此時，DNA會“變性”成單鏈狀態。②降低環境溫度（一般控制在60 ℃左右）后，單鏈與引物的堿基會自動完成“互補配對”。③再次升高環境溫度（此時無需升高至步驟①的程度，只需控制在72 ℃左右即可，而該溫度是最適合DNA聚合酶反應的溫度），此時，DNA聚合酶會沿著磷酸到五碳糖的方向完成互補鏈的合成。總體而言，PCR技術可視為“模擬DNA天然復制的過程”，特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物，經過上述3個階段后，會合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復制鏈重復循環變性--退火--延伸3過程，就可獲得更多的“半保留復制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環的模板。每完成一個循環需2～4 min，2～3 h就能將待擴增目的基因擴增放大幾百萬倍[2]。由此可見，使用PCR技術監測克羅諾桿菌時，即使按照最傳統、最原始的PCR合成方法，只需數個小時便可確定被檢測物品內是否含有克羅諾桿菌。

2.2 實時熒光定量聚合酶鏈式反應技術

此種技術的本質仍然是PCR技術，是指在DNA擴增反應的過程中，使用熒光化學物質，對PCR循環后產物的總量進行測量，并通過內參法或外參法，對檢測樣品中特定的DNA序列進行定量分析。具體而言，在PCR擴增的指數時期，檢測模板的CT值（循環閾值）以及其拷貝數之間存在一種線性關系，而此種關系可以作為定量的依據。采用熒光定量PCR技術檢測克羅諾桿菌的具體方法分為2種。①SYBRGreen I法。在PCR反應過程中，加入過量的SYBR熒光染料，該染料具有特異性，摻入DNA的雙鏈后，能夠發射熒光信號，而沒有摻入鏈中的染料分子不會發射熒光信號。因此，SYBR熒光信號增加速度與PCR產物增加速度完全一致，只需繪制出SYBR定量PCR擴增熒光曲線圖，并與克羅諾桿菌DNA天然復制的曲線圖進行比對，即可判斷檢測樣本中是否含有克羅諾桿菌。②TaqMan探針法。此種方法的本質與SYBRGreen I法并無二致，同樣需要使熒光信號的積累（增長）與PCR產物的形成保持同步。實現方法為：在探針的完整程度尚未被破壞時，報告基團發射的熒光信號會被淬滅基團吸收；當PCR處于擴增階段時，Taq酶的5′-3′外切酶的活性將受探針酶的“切割”，進而降解。此時，報告熒光基團和淬滅熒光基團將會分離，之后便可使熒光監測系統收到相應的（熒光）信號。而隨著一條DAN鏈的形成，一個新的熒光分子也會同時間形成。

2.3 等溫擴增技術

等溫擴增技術全稱“基于恒溫擴增的核酸擴增技術”，包含環介導等溫擴增、交叉引物擴增、鏈替代擴增、重組酶聚合酶擴增、依賴核酸序列的擴增、依賴解旋酶的擴增和滾環擴增共7種具體類型[3]。受篇幅所限，本文以環介導等溫擴增為例進行介紹。使用該技術檢測克羅諾桿菌等病原菌的過程如下。①將內引物與目的基因相結合，在BstDNA聚合酶的作用下，可延伸為雙鏈。②外引物與雙鏈DNA的5′端會相互結合，并在一端形成環狀結構。另一端經歷的過程與此相同，最終會形成“兩端都有環狀結構，類似一個啞鈴”的結構形態。③啞鈴狀結構形態的單鏈DNA兼具模板和引物的功能，一旦受到Bst聚合酶的催化作用，便可延伸。④內引物同樣能夠與環狀結構相結合，并在聚合酶催化作用下延伸。相較于PCR技術，環介導等溫擴增技術無需模板的熱變形、溫度循環等過程，在30～60 min內，即可完成對檢測樣本的核酸擴增反應，檢測過程簡單、快速且特異性較強。

2.4 其他技術

從克羅諾桿菌本身的特性出發，可針對其特點制定出一種專用于檢測該菌的分子生物檢測技術。比如克羅諾桿菌具有革蘭氏陰性、α-葡萄糖苷酶活性、可產生黃色素等特性。基于此，有學者創設了一種只適用于克羅諾桿菌的檢測過程。①使用必不可少的重要物質——萬古霉素（一種糖肽類抗生素）和月桂基硫酸鹽，目的在于：檢測樣本中可能含有多種真菌、細菌（其中的很多菌種并不具有致病性，但在檢測過程中有可能影響對克羅諾桿菌的檢測結果），需要抑制陽性細菌的生長，從而保證克羅諾桿菌等革蘭氏陰性菌有較大的生長優勢。②使用顯色培養基對經過初步處理的樣本進行培養，原理在于：克羅諾桿菌內獨有的α-葡萄糖苷酶被活性水解后，會使培養基的第五顏色出現明顯的變化。而考慮到檢測樣本中可能同時存在不止一種腸桿菌科細菌，故需借助硝基苯-α-葡萄糖吡喃苷等物質加以區分（體現在顏色方面，上文提到，克羅諾桿菌能夠產生黃色素，故與硝基苯-α-葡萄糖吡喃苷等反應之后，培養基底物的顏色變化會產生明確的指向性，有助于檢測人員判斷）。③根據培養基底物顏色變化，進一步提出其他革蘭氏陰性菌等雜菌之外，便可以根據克羅諾桿菌的發酵特性、氧化酶活性、檸檬酸水解活性等生化特性，再一次確定檢測樣本中是否真正含有克羅諾桿菌。該檢測方式基于克羅諾桿菌的特性而設定，從原理上來說，只要有一個過程并不符合對應的結果，比如培養基底物顏色變化環節，如果并未出現克羅諾桿菌與硝基苯-α-葡萄糖吡喃苷反應后對應的顏色，實際上已經說明檢測樣本中不含有該菌。從相反方向進行分析，進入最后一個環節——基于發酵特性、氧化酶活性進行檢測時，是為了對最終檢測結果進行“定性”。

3 基于免疫學的快速檢測技術

3.1 免疫磁珠檢測技術

免疫磁珠是一種新型免疫學檢測技術，是指將固化試劑的優點與免疫反應的高度特異性相結合，并基于免疫學開展的檢測技術。具體原理為：運用核-殼的合成方法，完成含有超順磁性物質高分子表面覆蓋的復合材料，以及具有較強穩定性，能夠進行后期標記物質的合成。在檢測過程中，利用這些物質表面的功能集團（主要有氨基、羧基等），實現抗體的共價或非共價偶聯。在此基礎上，將特定的抗原或抗體（可視為檢測樣本）與上述物質相結合之后，在外加磁場的吸引作用下，檢測樣本中的很多物質會發生定向移動，進而完成分離、監測、基因純化等目的。采用此種方法檢測樣本中是否含有克羅諾桿菌的原理為：克羅諾桿菌抗體能夠與磁珠相結合，形成一種“抗克羅諾桿菌免疫磁珠”，可明顯提升核酸檢測靈敏度[4]。

3.2 酶聯免疫吸附檢測技術

該技術是指利用抗體分子、抗原分子特異性相結合的特點，使處于游離狀態的雜蛋白和結合于固相載體的目的蛋白相結合。在此基礎上，利用經過特殊標記的標記物，對檢測樣本進行定性、定量分析。具體而言，抗原或抗體會吸附在檢測樣本固相的表面，且免疫活性在很長一段時間內都能有效留存。此時向其中加入酶，可通過共價鍵形成酶結合物，并保持各自的免疫活性與酶活性。此時再加入檢測底物，根據顏色的變化情況，可確定免疫反應是否發生。從一定程度上來看，此種技術與上文提到的克羅諾桿菌特定生物化學檢測技術有部分相似之處。

3.3 重組酶等溫擴增試紙條檢測技術

此種技術是將重組酶聚合酶等溫擴增技術與免疫層析試紙條技術相結合，形成一種能夠在20 min內確定檢測樣本中是否含有克羅諾桿菌的技術。具體的檢測過程如下。①將檢測樣本從-80 ℃的環境中取出，置于冰盒上，取100 μL加入10 mL LB液體培養基中，37 ℃、200 r·min-1過夜培養。次日取出，按照細菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取細菌DNA，DNA于-20 ℃保存備用。②完成膠體金試紙條的制備。③選擇NC膜，完成樣品展開液的優化處理之后，重點針對檢測樣本的特異性和靈敏度進行檢測。具體方法遵照GB/T 4789.40—2016標準。將檢測結果與標準參照表進行對比，即可了解樣本中是否存在克羅諾桿菌[5]。

4 結語

克羅諾桿菌對特定人群有較強的致病性，而感染人群（主要是嬰幼兒）的途徑包含多種食品（主要是嬰幼兒奶粉）。從保證食品安全角度來看，針對流入市場的食品進行全方位檢測是必要的，也是無可置疑的。但從行業發展及管理的角度來看，檢測過程耗時同樣是大問題。如一些新鮮的果蔬，如果檢測時間較長，新鮮度便會降低，導致賣不上價。基于此，必須找到能夠在短時間內精準確定樣本中是否含有克羅諾桿菌的方法。本文介紹的PCR技術，針對克羅諾桿菌的特定檢測技術都能夠產生良好的效果，可推廣應用。