TGF-β在增殖性視網膜疾病中的研究進展

黎曉冬，李志林，武海燕，何潤西，羅雪妮，謝學軍

0引言

轉化生長因子-β(transforming growth factor beta，TGF-β)是具有調控細胞增殖、凋亡及分化等多種作用的細胞因子，其介導的經典和非經典信號通路通過調節肌成纖維細胞轉化與細胞外基質(extracellular matrix，ECM)重塑參與各種人體組織的纖維化進程。其中TGF-β介導的病理性纖維化可破壞正常的視網膜神經組織，誘發纖維血管瘢痕增生和繼發性視網膜脫落，導致不可逆的視力喪失，這可能與增殖性視網膜疾病的發病機制關系密切，故本文主要對TGF-β在增殖性視網膜疾病中的作用機制及未來治療前景作簡要闡述。

1 TGF-β簡述

TGF-β超家族包括TGF-β、激活素、抑制素、骨形態發生蛋白、生長分化因子等30多個成員，TGF-β是TGF-β家族蛋白中研究最多的多功能肽生長分化因子，在哺乳動物中已發現在氨基酸水平上有70%～82%同源性的TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3三種亞型，其在控制細胞生長發育、增殖、分化、凋亡，組織修復，血管生成及炎癥等過程中發揮著關鍵作用[1-2]，TGF-β失調可介導多種病理過程，導致組織纖維化、慢性炎癥、免疫抑制等[3-4]。TGF-β最初以無活性的同型二聚體形式存在，經mRNA翻譯后，無活性的TGF-β前體被加工并分泌到ECM中，與TGF-β結合蛋白(TGF-β binding protein，LTBP)和潛伏期相關蛋白(latent protein，LAP)形成TGF-β/LAP/LTBP復合物保持無活性狀態[5]，隨后被纖溶酶、基質金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)、基質金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)及血小板反應蛋白等多種蛋白酶激活釋放出活化的TGF-β，與細胞膜上的TGF-β受體2(TGF-β receptor 2，TGFR2)相結合，此時涉及經Smads介導的經典信號通路和非Smads介導的其它信號通路，經典信號通路通過TGFR2募集并激活TGFR1后以激活Smad2和Smad3信號，再與Smad4結合生成Smads復合體易位至細胞核與DNA結合轉錄因子和輔因子相互作用以激活或抑制靶基因表達[6]；非Smads介導的信號通路包括PI3K/Akt/mTOR信號通路、細胞外信號調節激酶(extracellular-signal regulated kinase，ERK)、p38絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK)和c-Jun氨基末端激酶(c-Jun terminal kinase，JNK)通路及Rho樣GTPase信號通路。多數TGF-β受體位于細胞內，研究表明TGF-β誘導的低水平細胞表面TGF-β受體激活時，可以迅速將細胞內的TGF-β受體轉移到細胞表面，從而增加細胞表面TGF-β受體的豐度和細胞對TGF-β信號的反應[7]。

2眼內的TGF-β

TGF-β三種亞型在眼內房水及玻璃體液中均能檢測到，目前尚未檢測到活性的TGF-β1，且玻璃體內87%的TGF-β以無活性形式存在。TGF-β2是房水和玻璃體液中的主要亞型，研究顯示房水中TGF-β2∶TGF-β3∶TGF-β1三種具有活性的亞型的比率為1∶0.4∶0[8]，此外，通過免疫熒光定位的方法顯示TGF-β三種亞型在眼前節及眼后段組織細胞中分布不均勻，見表1。

表1 眼部TGF-β三種亞型分布情況

3 TGF-β與纖維化

纖維化過程通常持續數月至數年，涉及到生長因子，炎癥介質和ECM組分之間的動態相互作用，可以影響全身任何器官，且有數據表明因器官衰竭導致的死亡率高達45%[9]。纖維化可以定義為組織正常結構成分破壞時，細胞通過上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)為肌成纖維細胞，產生大量炎癥介質及異常的ECM蛋白(包括膠原蛋白、層黏連蛋白、纖連蛋白和肌腱蛋白)，過量異常ECM蛋白不僅導致分泌的ECM積累過多，還能間接重塑ECM，導致瘢痕和無功能組織的形成[10]。因此肌成纖維細胞轉化與ECM積累是纖維化過程的主要影響因素。目前研究證實TGF-β信號通路在肌成纖維細胞轉化過程中起主要作用，通過激活經典信號通路中Smad3直接與基因啟動子結合誘導促纖維化分子的轉錄，誘發肌成纖維細胞活化和ECM沉積[11]；也有研究表明TGF-β可以直接通過上調ECM蛋白的表達調節ECM積累[12]。病理性瘢痕真皮成纖維細胞分泌高水平的TGF-β，通過激活素樣激酶 5(activin-like kinase 5，ALK5)發出纖維化基因轉錄的信號。既往研究在傷口愈合的體外模型中發現了ALK5的小分子抑制劑—galunisertib，該研究用外源性TGF-β誘導人真皮成纖維細胞纖維化，體外劃痕實驗顯示，galunisertib能顯著增強細胞遷移和體外傷口閉合，且基因表達分析顯示纖維化基因表達顯著減弱，抗纖維化基因表達增加，蛋白質合成測定證實了藥物活性及轉錄結果。這表明galunisertib可對真皮成纖維細胞發揮抗纖維化作用，同時提高體外傷口閉合率[13]。

4 TGF-β與增殖性視網膜疾病

TGF-β信號通路介導纖維化過程破壞正常的視網膜神經組織，誘發纖維血管瘢痕增生和繼發性視網膜脫落，導致不可逆的視力喪失。與纖維化相關的增殖性視網膜疾病主要為增生性玻璃體視網膜病變(proliferative vitroretinopathy，PVR)、新生血管性年齡相關性黃斑變性(neovascular age-related macular degeneration，nARMD)和增殖期糖尿病視網膜病變(proliferative diabetic retinopathy，PDR)等纖維血管膜形成相關的疾病[14]。

4.1TGF-β與PVR PVR是經手術修復視網膜脫離后的一種嚴重并發癥，其發病特點是視網膜表面形成無血管的纖維細胞性增殖膜。這些繼發性視網膜前膜的形成與收縮導致視網膜結構改變，致視網膜褶皺、撕裂甚至牽引性視網膜脫離[15]；研究表明，PVR繼發的纖維膜主要由RPE細胞、成纖維細胞、肌成纖維細胞、神經膠質細胞和巨噬細胞等異質細胞群和過量的ECM組成，成纖維細胞和肌成纖維細胞被認為是纖維膜內的主要收縮細胞表型。在EMT期間細胞間黏附和頂面-底側細胞極性的缺失使得RPE細胞表型發生改變，TGF-β誘導RPE細胞為成纖維細胞與肌成纖維細胞，促進細胞增殖、遷移和過量的ECM生成參與纖維膜的形成，并在應力纖維中表達α-平滑肌肌動蛋白，增加纖維膜收縮性，導致牽引性視網膜脫離，上述過程在PVR的發病機制中起關鍵作用[16]。此外，多項研究證明TGF-β/Smad經典信號通路在RPE細胞EMT過程的重要性；Saika等[17]通過特定視網膜下纖維化的小鼠模型發現阻斷TGF-β/Smad信號通路下游的關鍵蛋白Smad3，可以抑制RPE細胞的EMT過程從而阻止PVR的進展。Choi等[18]利用人RPE細胞系ARPE-19模型研究發現，抗纖維化藥物吡非尼酮可明顯抑制TGF-β1誘導的成纖維細胞樣表型，且呈劑量依賴性，其通過阻止活性Smad2/3復合物的核轉位抑制TGF-β信號通路。此外，國內學者發現甲基CpG結合蛋白2(methyl CpG binding protein，MeCP2)的下調也可以抑制TGF-β誘導的Smad2/3激活和Ⅰ型膠原和纖連蛋白的表達，通過染色質免疫沉淀法發現MeCP2與TGF-β結合，且P-MeCP2-421在PVR膜中高表達，提示MeCP2特別是P-MeCP2-421可能在PVR發病機制中發揮重要作用，靶向MeCP2可能是PVR的一種潛在治療方法[19]。另有研究顯示，PVR患者玻璃體液中TGF-β1表達明顯增高，但其表達量與PVR臨床嚴重程度分級無直接關系，可能在其病程的初始階段具有更大的相關性[20]。

同時，TGF-β非經典信號通路在調節RPE細胞的EMT過程中也起重要作用，如TGF-β2通過激活p38 MAPK、ERK1/2和Jagged/Notch信號抑制人RPE細胞中EMT過程[21]，且TGF-β2誘導的PI3K/Akt信號途徑的激活有助于RPE細胞中Ⅰ型膠原的表達與合成[22]。此外，在PVR患者的玻璃體和增殖纖維膜中檢測到TGF-β水平上調，尤其是TGF-β2及其受體表達水平上調與PVR嚴重程度呈正相關[23]。Trichostatin A是一種組蛋白去乙酰化酶抑制劑，已被證明可同時抑制經典TGF-β/Smad信號通路和非經典通路，并通過阻止α-平滑肌肌動蛋白、纖連蛋白、Ⅰ型和Ⅳ型膠原蛋白、轉錄因子Snail及Slug的表達上調抑制TGF-β誘導的RPE細胞EMT過程[24]；有研究在PVR小鼠模型和體外人ARPE-19細胞實驗中發現Yes相關蛋白(Yes-associated protein，YAP)的激活與TGF-β2信號通路密切相關，YAP還是PVR中EMT和纖維化反應的重要調節因子，抑制YAP可能是PVR治療干預的潛在靶點[25]。此外，一項動物實驗表明活化的凝血因子X(activated blood coagulation factor X，FXa)可以通過促進RPE的EMT過程加劇外傷性PVR的發展[26]。上述研究提示對于防治PVR的新藥研發前景十分可觀。

4.2TGF-β與nARMD 年齡相關性黃斑變性(ARMD)是一類涉及黃斑深層和周圍脈管系統的病理改變，從而導致中心視力喪失的致盲性眼底疾病，是60歲以上人群不可逆失明的原因，影響全球近2億人。根據病理特征主要分為干性ARMD和nARMD，以黃斑周圍玻璃膜疣為特征的干性ARMD約占所有患者的80%～85%，通常具有更好的視力預后；其余15%～20%的患者為nARMD，黃斑處脈絡膜新生血管(choroidal neovascularization，CNV)導致視網膜出血和滲出，視力下降嚴重，治療不及時最終導致視網膜下纖維化、瘢痕化及永久性視力喪失，約占因ARMD導致視覺功能嚴重下降患者的80%[27]。視網膜下纖維化是CNV之后的傷口愈合反應，其特征是TGF-β等生長因子及炎性因子可以誘導RPE細胞發生EMT，導致過量ECM的實質性重塑[28]。體外實驗發現，在ARPE-19細胞中，TGF-β誘導EMT的經典介質即轉錄因子Snail的表達，Snail可促進血管內皮鈣黏蛋白和緊密連接蛋白的表達減少，介導纖連蛋白和α-平滑肌肌動蛋白的表達增加，從而誘導細胞的遷移活性，TGF-β2促進ARPE-19細胞通過介導尿激酶型纖溶酶原激活物的表達侵入膠原凝膠，誘導過量Ⅰ型膠原和纖維連接蛋白的合成與表達[29]，這兩種ECM蛋白參與視網膜下纖維化破壞視網膜功能和神經元變性[30]。Moon等[31]發現蛋白酶體抑制劑硼替佐米可有效抑制RPE細胞的增殖、遷移及阻斷TGF-β1信號通路介導的RPE細胞EMT；維甲酸受體-γ激動劑也可以抑制RPE細胞的EMT，延緩TGF-β介導的視網膜下纖維化反應[32]。另有研究發現腎上腺髓質素(adrenomedullin，AM)及其受體活性修飾蛋白2(receptor activity-modifying proteins，RAMP2)敲除的小鼠模型表現出新生血管形成、視網膜下纖維化和巨噬細胞侵襲，使用TGF-β抑制劑后AM-RAMP2敲除小鼠視網膜下纖維化明顯改善，表明AM-RAMP2是通過阻斷RPE細胞EMT抑制視網膜下纖維化[33]。因此，nARMD患者接受TGF-β抑制劑的治療，可能在一定程度上延遲EMT和視網膜下纖維化的發生，從而獲得更好的視力預后。可溶性極低密度脂蛋白受體(sVLDLR)是一種內源性Wnt信號抑制劑，研究發現過度激活Wnt信號通路可以增強TGF-β通路，而sVLDLR可能是部分通過抑制Wnt信號通路達到抑制nARMD中視網膜下纖維化進展的目的[34]。

TGF-β在nARMD中可能具有促血管生成功能。通過靶向激光損傷RPE和Bruch膜誘導CNV生成的動物模型是研究nARMD的金標準動物模型，研究發現在小鼠CNV形成過程中TGF-β1和TGF-β2 mRNA表達明顯上調，而對照組正常小鼠的TGF-β為低表達水平；此外，通過腹膜內或玻璃體內注射TGF-β抑制劑LY2157299可以下調視網膜中VEGF-A和TNF-α的表達水平，這有助于預防或阻止早期CNV形成與進展[35]；且研究證實nARMD患者房水、玻璃體液及黃斑RPE中TGF-β表達顯著升高[36]，表明抑制TGF-β信號通路對于nARMD的治療具有潛在意義。目前有爭議的是有研究支持TGF-β在nARMD中還有抗血管生成功能。在轉基因小鼠模型中，過度表達的活性TGF-β1可誘導脈絡膜毛細血管萎縮而未發現任何CNV跡象[37]；在氧誘導的視網膜病變小鼠模型中，腹膜內注射人胎盤羊膜來源的間充質干細胞遷移到視網膜中并通過TGF-β1表達可以抑制CNV的形成[38]；這可能與TGF-β1通過抑制微血管內皮細胞增殖并下調局部VEGF和VEGF受體的表達水平有關。因此，多數學者認為在nARMD早期階段，TGF-β顯示出抗血管生成功能，而在類似于急性損傷或晚期階段TGF-β則促進血管生成[36]，如何選擇靶向TGF-β的治療還需要更多有針對性的研究闡明其具體作用機制。

4.3TGF-β與PDR 糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病最常見的慢性神經及微血管并發癥之一，并且仍然是全球導致視力喪失和失明的主要眼底疾病之一。糖尿病會改變視網膜正常的細胞間相互作用，并導致嚴重的微血管異常，血-視網膜屏障破壞和神經元功能受損；隨著病情進展，視網膜缺血缺氧加重，釋放大量VEGF、炎癥及纖維化因子，促進視網膜新生血管、纖維血管膜形成，導致玻璃體積血甚至牽拉性視網膜脫離，這表明已發展至PDR階段，視覺嚴重受損且預后很差[39]。Ahmed等在14例PDR患者的纖維血管膜中發現，內皮細胞及循環纖維細胞可以經EMT分化肌成纖維細胞并促進PDR中的視網膜病理性纖維化，同時體外研究也證實暴露于TGF-β1、結締組織生長因子、白細胞介素-1β及TNF-α條件下的人視網膜微血管內皮細胞形態改變，失去內皮細胞標志物(內皮型一氧化氮合酶和血管內皮鈣黏蛋白)的表達并開始表達間充質標志物(α-平滑肌肌動蛋白和成纖維細胞特異性蛋白-1)[40]。肌成纖維細胞可通過分泌MMP-2和MMP-9促進內皮細胞遷移并釋放大量VEGF，導致新生血管的形成[28]。TGF-β尤其是TGF-β2在PDR患者的玻璃體中表達上調，與PDR期間VEGF的產生密切相關。Braunger等[41]發現長時間缺乏TGF-β基因的TGFBR2小鼠模型表現出PDR的表型特征，視網膜有大量微動脈瘤、毛細血管滲漏和視網膜新生血管形成，血管平滑肌樣細胞和增厚的基底膜替代分化的周細胞覆蓋視網膜毛細血管管壁，在4月齡的TGFBR2小鼠模型中觀察到終末期PDR表型特征，包括大量內皮細胞丟失、視網膜新生血管形成導致視網膜脫離及玻璃體積血等。此外，TGF-β可通過結締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF)發揮促纖維化作用，且CTGF在晚期PDR發生的血管纖維化轉換中十分關鍵。糖尿病大鼠視網膜中TGF-β表達上調，CTGF mRNA表達增加，終末期PDR模型中TGF-β在瘢痕樣纖維膜中表達顯著上調[42]。

內皮素(endothelin，ET)是一種有效的血管收縮劑，以3種同種型存在，即ET-1、ET-2和ET-3，其中ET-1及其受體ETA已被證明可介導高血糖和DR期間視網膜血流減少[43]，DR早期階段，ET-1可通過受體ETA介導周細胞凋亡[44]；William等發現PDR增殖膜中ET-1和成纖維細胞免疫染色比特發性前膜中更明顯，且ET-1和S100A4(成纖維細胞標志物)染色共定位表明ET-1在PDR中上調并可能參與TGF-β介導的成纖維細胞的轉變與增殖，故ET-1有可能成為防治PDR的潛在靶點[45]。一項臨床對照研究發現，血清TGF-β1可以成為預測PDR進展的生物標志物，且可以作為評估抗VEGF治療后臨床療效的指標[46]。也有研究顯示，PDR及合并新生血管性青光眼的PDR患者房水中TGF-β水平明顯升高，檢測房水TGF-β水平有助于及時調整治療方案和監測治療反應[47]。

5小結與展望

TGF-β信號通路介導的纖維化在PVR、ARMD及PDR等增殖性視網膜疾病的發病機制中十分關鍵，RPE細胞EMT過程及ECM的過量積累是纖維化的兩個主要特征表現；阻斷TGF-β及其下游通路中蛋白激活的抑制劑可能是防治增殖性視網膜疾病的潛在治療靶點之一，然而，基于TGF-β信號通路中調節因子的多樣性和潛在信號傳導途徑的復雜性，抑制視網膜組織病理性纖維化可能需要多種因素的聯合靶向治療。特異性阻斷參與肌成纖維細胞轉分化的下游TGF-β信號通路，保留視網膜穩態內環境及正常功能所需的TGF-β信號通路可能更有利于增殖性視網膜疾病的早期防治。隨著有關纖維化眼病發病機制的深入研究，我們期望能夠研發出新的有效的對抗病理性纖維化的藥物及手段，助力于臨床上增殖性視網膜疾病的防治。