金剛丸對絕經后骨質疏松模型大鼠NF-κB p65表達及IL-1、IL-6、TNF-α的影響*

陳 杰，沈琳玲，戎 寬，朱亮亮，葉子豐，匡浩銘，匡建軍

(1.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208；2.湖南省中醫藥研究院附屬醫院，湖南 長沙 410006；3.湖南省中醫藥研究院，湖南 長沙 410006)

絕經后骨質疏松(postmenopausal osteoporosis，PMOP)是生活中十分常見的一種疾病，好發于更年期后的絕經后女子，由于女子在絕經后卵巢功能逐步萎縮，導致雌激素釋放能力降低、內分泌發生改變，可引起骨量丟失、骨強度降低、骨組織結構損壞、骨質易脆，骨折風險風險明顯增高[1]。當婦女體內雌激素水平下降，引起相關免疫反應增強、T細胞增殖，炎癥因子大量分泌[2]，大量研究表明[3]IL-1、IL-6、TNF-α等炎癥因子對破骨細胞的生成與活化起著重要作用，同時亦有研究表明[4]NF-κB家族是與破骨細胞的生成與活化密切相關。由于PMOP西藥治療有一定的不良反應，開展PMOP的中醫藥治療有著深遠意義。在中醫理論中PMOP癥屬“骨痿”，病機以腎虛為主，當治以補腎壯骨。金剛丸在臨床應用中，治療PMOP療效較好。本研究通過去卵巢法建立絕經后骨質疏松模型，觀察金剛丸對其血清中IL-1、IL-6、TNF-α含量及NF-κB p65表達的影響，以探索金剛丸治療PMOP的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選用56只6月齡SPF級Sprague-Dawley(SD)未經產雌性大鼠，體重(300±20)g，動物來源：湖南省中醫藥研究院實驗動物中心，動物許可證號批號：43602500000352。

1.2 實驗藥物 金剛丸：具有補腎生津、溫陽益髓之功。將酒浸肉蓯蓉、酒浸菟絲子、鹽炒杜仲、萆薢各120 g等分為細末，隨后通過與酒煮豬腰子蜜制成丸。(藥物來源：陜西天洋制藥有限公司生產；藥品批準文號：Z61020726，丸劑，成人劑量：每日2次，每次1丸，每丸3.5 g)。戊酸雌二醇片(法國 DELPHARM Lille S.A.S.生產；藥品批號：219A；成人劑量：每日1次，每次1粒，每粒1mg)。

1.3 實驗試劑 10%水合氯醛(上海山浦 批號：20191016)、IL-1試劑盒(酶聯生物 批號：ml037373)、IL-6試劑盒(酶聯生物 批號：ml102828)、TNF-α試劑盒(酶聯生物 批號：ml002859)、P65抗體(英國abcam 批號：ab16502)、石蠟(Sigma)、中性樹膠(Sigma)、蘇木素(Wellbio)、PBS(7.2-7.6)(Wellbio)、伊紅(Wellbio)。

1.4 實驗儀器

名稱廠家全稱貨號臺式高速冷凍離心機湖南湘儀H1650R搖床中國江蘇其林貝爾TS-1電泳儀中國北京六一DYY-6C轉膜儀中國北京六一DYCZ-40D磁力攪拌器中國雷磁JB-13普通冰箱中國奧克斯BCD-196A電磁爐荷蘭飛利浦HD4925精密PH計中國雷磁PHS-3C電子天平美國雙杰JJ224BC化學發光成像系統廣州勤翔Chemiscope6100

1.5 方法

1.5.1 造模方法 模型組：用百分之十水合氯醛(0.3 mL/100 g)，針對40只雌性SD大鼠采用腹腔內麻醉的方式來展開實驗。在手術臺上用剃毛器備皮后進行消毒。在大鼠最下的肋骨水平、腹中線左/右側旁開2～3 cm做一豎行切口，在進入腹腔后可以發現一乳白色脂肪團，鈍性剝離后找到卵巢。在子宮及卵巢之間，用手術線結扎后摘除卵巢。假手術組：8只大鼠做同樣的手術切口，切除同等重量脂肪組織后立即縫合切口。術后連續3天，予以每只手術大鼠8萬單位青霉素(1次/天)防止感染。

1.5.2 分組方法 進行1周適應性喂養后，把56只SD大鼠劃分為空白組(NtCn=8)、假手術組(SHAMn=8)、去勢大鼠組(OVXn=40)。模型驗證完成后，采用隨機數字表法把40只去勢大鼠均等的劃分為模型組、戊酸雌二醇組、金剛丸低劑量組、金剛丸中劑量組、金剛丸高劑量組共5組大鼠。

1.5.3 干預方法 各組每天上午灌胃給藥1次，根據《藥理實驗方法學》[5]中的方法，依據人類和大鼠表面體積存在差異來進行有效核算。具體方案如下：

組別生藥含量水溶液含量戊酸雌二醇組0.09mg·kg-1·d-10.009mg·mL-1金剛丸低劑量組1.8 g·kg-1·d-10.18 g·mL-1金剛丸中劑量組3.6 g·kg-1·d-10.36 g·mL-1金剛丸高劑量組7.2 g·kg-1·d-10.72 g·mL-1

對假手術組、空白組、模型組大鼠采用1 mL/100 g的蒸餾水灌胃。各組一共灌胃治療12周，每周6天，密切監測體重變化，及時調節給藥劑量。

1.5.4 標本制作方法 給藥后12周取材。用水合氯醛實施麻醉后，開腹找到腹主動脈，使用真空采血管收集血液標本。把收集的全血標本放置于室溫中靜置，離心后收集血清以用于檢測。隨后剪斷大鼠腹主動脈，再取雙側脛骨，以4%中性多聚甲醛固定，封口袋密封后保存備用。

1.6 實驗指標測定 用HE染色法觀察骨組織形態，ELISA法檢測血清IL-1、IL-6、TNF-α含量，Western Blot法檢測大鼠股骨NF-κB p65的表達。

2 結果

2.1 金剛丸對大鼠骨組織形態的影響 HE染色結果顯示：正常組和假手術組骨小梁形態完整、無明顯斷裂，骨髓腔正常，骨細胞排列均勻；模型組骨小梁形態模糊、廣泛斷裂，骨髓腔增寬，骨細胞排列散亂；戊酸雌二醇組、金剛丸高、中、低劑量組可見骨小梁形態較模型組改善、結構較為緊密，骨髓腔減小，骨外膜排列較為齊整。見圖1。

圖1 金剛丸對大鼠骨組織形態的影響(HE，×100)

2.2 金剛丸對大鼠血清TNF-α的影響 相較于空白組和假手術組對比分析而言，模型組及各給藥組血清IL-1、IL-6、TNF-α含量均上升，差異有統計學意義(P<0.05)；相較于模型組相對比分析而言，各給藥組血清IL-1、IL-6、TNF-α含量均下降，差異有統計學意義(P<0.05)；相較于戊酸雌二醇組、金剛丸中、低劑量組比較分析而言，金剛丸高劑量組血清IL-1、IL-6、TNF-α含量顯著下降，差異有統計學意義(P<0.05)；金剛丸高劑量組與其余各給藥組相比較而言，對血清IL-1、IL-6、TNF-α的抑制作用更為突出。見表1。

表1 金剛丸對大鼠血清IL-1、IL-6、TNF-α的影響

2.3 金剛丸對大鼠股骨NF-κB p65表達的影響 相較于空白組和假手術組對比分析而言，模型組股骨p65含量明顯上升，差異有統計學意義(P<0.05)；相較模型組對比分析而言，各給藥組股骨p65含量均有所下降，其中戊酸雌二醇組、金剛丸高劑量組下降明顯，差異有統計學意義(P<0.05)。金剛丸高、中、低劑量組組間比較，高劑量組股骨p65含量比中劑量組低，差異有統計學意義(P<0.05)，中劑量組股骨p65含量比低劑量組低，差異有統計學意義(P<0.05)。隨著金剛丸藥物濃度的升高，股骨p65含量呈下降趨勢。見表2、圖2。

表2 金剛丸對大鼠股骨NF-κB p65表達的影響

圖2 金剛丸對大鼠股骨組織中蛋白電泳的影響

3 討論

PMOP隨著中國老齡化加劇發病率也隨之快速升高，越來越多的中老年絕經后女性遭此病困擾。當女性絕經后機體內雌激素分泌量會迅速降低，進而引起骨代謝紊亂、骨量減少、骨脆性增加，其臨床表現多樣，以全身關節疼痛、骨骼退化變形、脆性骨折最為常見[6]。由骨形成和骨吸收構成的骨重建，發生于人體生命的每個階段，當破骨細胞超過成骨細胞主導的骨形成后OP隨即發生。在正常人體代謝過程中，成骨與破骨所需時間完全不同，相較于破骨細胞而言成骨細胞需要消耗更多的時間才能有效的實現同等量的骨形成[7]。因此抑制破骨細胞活性、降低破骨細胞功能、減少骨吸收在抗骨質疏松治療過程中占重要地位。依據大量研究得到結果顯示[8-9]，IL-1、IL-6、TNF-α等炎癥因子和NF-κB信號通路對于調節骨細胞功能以及促進機體機能具有重要的現實意義。

絕經后女性卵巢功能減退，體內雌激素分泌驟然減少，相關免疫活動隨之增強，大量炎性因子被釋放到體內，機體長期處于慢性炎癥環境之中[10]。有研究顯示[3]，炎性因子促進骨吸收的機制可能在于其作用于間質干細胞和破骨細胞前體，加快了破骨細胞分化成熟。IL-1、TNF-α均可誘導核因子-κB受體活化因子配體(RANKL)分泌增加，核因子-κB受體活化因子(RANK)與RANKL結合后可激活NF-κB信號通路，促使破骨細胞成熟。IL-6對PMOP有著雙重調節作用，既能增強骨的形成，也能促進骨的吸收，總的來說，促進骨吸收作用大于骨形成[11]。NF-κB是體內調控細胞增殖分化及炎癥的重要轉錄因子，NF-κB信號通路在沒有被激活時，NF-κB抑制因子IκBα與NF-κB緊密結合在一起，分布于胞質中。當RANKL與RANK相結合后在受體因子的影響作用下IκBα激酶 IKKs被活化，IKKs分解IκBα，促使其與NF-κB分離，NF-κB隨即移動到細胞核內，能夠參與到骨細胞的生長調節中[12]。NF-κB家族有五個成員，NF-κB p65是其中之一，有研究表明[13]：NF-κB p65與骨密度(BMD)呈負相關。因此，NF-κB p65在絕經后骨質疏松的病理過程中起到了重要作用，它將可能成為研究藥物對PMOP治療作用的新靶點。

PMOP是現代醫學上的名稱，中醫典籍中尚未找到該疾病名稱的明確記錄，根據全身骨痛、乏力、肢體痿軟等臨床表現，“骨痹”、“骨痿”的癥狀與其十分相似。結合臟腑、八綱、氣血精液辨證，該病涉及腎、肝、脾等多個臟腑，病機總屬本虛標實，腎精虧虛、肝郁血虛在中醫中屬于常見的虛證證型，其中腎精虧虛尤為緊要[14]。腎主骨，乃先天之本，腎精充沛則髓化生有源，骨質得養[15]。石敏等研究[16]指出：中醫“腎”在臨床中能夠顯著地作用于OPG/RANK/RANKL等信號通路并直接參與到調解中，骨的生長發育和代謝與其之間是密切關聯的，腎精虧虛則骨髓化生無源，導致PMOP發生。金剛丸是補腎經典方，全方包含的中藥材為肉蓯蓉、菟絲子、杜仲、萆薢、酒煮豬腰。菟絲子性味辛甘，有補腎益精填髓的作用，現代藥理學研究發現[17]：其主要活性成分菟絲子黃酮可通過下調Bax蛋白表達，上調Bcl-2、OPG蛋白表達，進而抑制成骨細胞凋亡；肉蓯蓉味甘咸、性溫，有補腎陽益精血的功效，朱剛等[18]研究發現：肉蓯蓉醇提物可以上調OP模型大鼠骨鈣素、鈣離子及血清堿性磷酸酶水平，進而提高大鼠股骨生物力學功能；杜仲性味甘溫，入肝腎經，善于補肝腎、強筋骨，研究發現[19]：杜仲不僅能促進成骨細胞活化進而促進骨形成，且可以遏制炎癥因子活性，降低其對骨破壞的誘導作用；萆薢味苦，善于分清泄濁，祛腎濁而留腎精，藥理研究[20]認為其可從分子水平對成骨細胞UMR106促增殖活，抑制破骨樣多核細胞形成；配豬腰子血肉有情之品，暖腎以補先天之氣，酒煮后助行藥力，加強補腎功效。諸藥聯合，共同發揮補腎健骨、填精生髓的功效。

本研究采用3個梯度的金剛丸濃度及陽性對照藥戊酸雌二醇片干預模型大鼠，在干預12周后檢測大鼠血清中IL-1、IL-6、TNF-α的含量及股骨組織中NF-κB p65的含量。研究結果顯示，戊酸雌二醇組、金剛丸高、中、低劑量組可見骨小梁形態較模型組改善、結構較為緊密，骨髓腔減小，其中金剛丸高劑量組改善明顯，骨外膜排列整齊。可見金剛丸可明顯改善骨組織形態。金剛丸能降低大鼠血清中IL-1、IL-6、TNF-α含量和股骨組織NF-κB p65的蛋白表達，降低骨質疏松大鼠炎癥程度，參與調控成骨細胞與破骨細胞的增殖和分化，這可能是金剛丸能夠緩解PMOP臨床癥狀的重要因素。且其作用對于金剛丸呈現一定劑量依賴性。總而言之，本研究證實金剛丸能降低IL-1、IL-6、TNF-α含量、下調NF-κB p65表達水平，其治療作用與藥物濃度呈正相關，初步闡釋了金剛丸抗骨質疏松的作用機制。