基于網絡藥理學的山豆根抗炎活性成分辨析與靶點預測*

周沁陽，趙景云

(1.中國藥科大學中藥學院，江蘇 南京 211198；2.云南省中醫中藥研究院，云南 昆明 650223)

山豆根為豆科植物越南槐 Sophora Tonkinensis Gagnep(STG)的干燥根和根莖。2020年版《中國藥典》中記載山豆根性味苦，寒，有毒；具清熱解毒，消腫利咽之功，用于火毒蘊結，乳蛾喉痹，咽喉腫痛，齒齦腫痛和口舌生瘡[1]。山豆根用藥歷史悠久，臨床運用廣泛，具有較高藥用價值和經濟價值。研究發現山豆根中化學成分主要包括生物堿、黃酮、多糖和三萜和芳香類化合物等，具有抗乙肝和人免疫缺陷病毒、抗氧化、抗腫瘤、保肝、提高免疫力、降壓以及解痙止瀉等生物活性[2-3]。2020年版《中國藥典》以苦參堿(matrine)和氧化苦參堿(oxymatrine)作為其質量控制指標。

炎癥反應(inflammation)是一系列損傷因子引起具有血管系統的活體組織產生主動性的防御，多種疾病的發病與此有關[4]。炎癥反應是很多疾病，包括動脈粥樣硬化、缺血性腦卒中和炎癥性腸病等的病理基礎[5-6]。現代藥理學研究顯示，大部分苦參堿型生物堿具有明顯鎮痛抗炎活性，其中鎮痛作用較強的為苦參堿和槐定堿，對耳腫脹抑制作用較強的為槐果堿、氧化苦參堿和鷹爪豆堿[7]。觀察山豆根顆粒及其飲片對LPS小鼠急性炎癥模型，小鼠血清NOS、NO、MDA、TNF-α和IL-6等含量的影響，提示山豆根顆粒及其飲片各劑量均能顯著抑制小鼠足腫脹度[8]。山豆根水提組分對混合致炎液所致咽喉實熱證模型小鼠耳腫脹具有較強抑制作用[9]。山豆根藥代動力學研究表明，其水提物能以劑量依賴性，對角叉菜膠致大鼠足跖腫脹模型發揮抗炎作用，且藥效與體內苦參堿系統暴露量成正相關[10]。山豆根主要成分之一槐果堿能夠抑制LPS介導的小鼠巨噬細胞RAW264.7的炎癥反應，其機制可能與干預NF-κB信號通路有關[11]。最近研究發現，苦參堿氯化鈉注射液能夠有效緩解新型冠狀病毒肺炎(doro-navirus disease 2019，COVID-19)模型小鼠的肺部損傷，降低其肺組織中病毒核酸載量和相關炎癥介質水平，提高外周血淋巴細胞比例[12]。以上文獻回顧提示，山豆根及其效用成分具有良好的抗炎作用。

針對中藥具有多成分，作用多靶點以及多通路的特點，近年來應運而生的網絡藥理學，旨在研究藥物、疾病、靶點和通路之間相互作用關系，研究建立“成分-靶點-通路”網絡，分析預測多種藥物成分在體內的互作關系[13]。網絡藥理學強調藥物作用通路的多靶點與多途徑，與中藥治療疾病的原理相契合，為傳統中醫藥現代化發展提供了新思路。本研究將采用網絡藥理學研究方法，對山豆根抗炎活性成分以及潛在靶點進行研究探討，為進一步詮釋其可能的抗炎作用機制，促進臨床合理用藥以及相關藥物研發等拓展新思路，并提供相應理論依據。

1 材料與方法

1.1 數據庫及軟件 化合物數據庫PubChem(https：// pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)；整合型生物信息及疾病基因數據庫GeneCards(https：//www.genecards.org/)；疾病靶點標準化數據庫Uniprot(https：//www.uniprot.org/)；中藥系統藥理學分析平臺TCMSP(http：//tcmspw.com/tcmsp.php)；藥效團匹配與潛在識別靶標平臺PharmMapper(http：//www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/)；蛋白互作數據庫String(https：//string-db.org/)；富集分析數據庫DAVID 6.8(https：//david.ncifcrf.gov/)；R語言4.1.2軟件；Cytoscape 3.8.0軟件。

1.2 藥物相關抗炎活性成分及藥物靶點篩選 在TCMSP搜索引擎中輸入“山豆根”進行檢索得到目標化合物信息，在TCMSP數據庫中設定口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥ 30%和類藥性(drug-likeness，DL)≥ 0.18作為化合物篩選條件。在Pubchem中輸入對應化合物的CAS號，下載其sdf格式文件。將對應化合物的sdf格式文件導入PharmMapper網站，僅從人類蛋白靶點數據中進行匹配(Human Protein Targets Only)，得到化合物潛在靶點，下載數據文件備用。

1.3 疾病靶點篩選與靶點標準化 通過GeneCards數據庫以疾病名稱“Inflammation”進行檢索，得到炎癥疾病相關靶標。利用Uniprot數據庫分別上傳得到的藥物潛在靶點與疾病靶點名稱，蛋白種屬設置為智人“homo sapiens”，獲取其靶點的標準基因名。將二者相互映射，得到山豆根抗炎活性成分潛在靶標。

1.4 藥物靶蛋白—疾病靶蛋白網絡的建立與拓撲分析 將篩選得到的共有靶標上傳至String平臺，選擇“multiple proteins”，蛋白種屬及背景設為“homo sapiens”，以最高置信度位篩選條件“highest confidence(≥0.9)”進行篩選，建立“藥物靶蛋白—疾病靶蛋白”(PPI)相互作用網絡，得到PPI相互作用關系網絡并下載備用。將文件導入Cytoscape 3.8.0軟件，使用內置插件CytoNCA，Centralities項下除“degree”外全部選取并進行拓撲分析，導出分析結果，以點度中心性(Degree Centrality，DC)、接近中心性(Closeness Centrality，CC)和中介中心性(Betweenness Centrality，BC)篩選核心靶點。

1.5 “成分-靶點-通路”可視化網絡的建立 以PPI結果篩選出的潛在靶點、活性成分建立屬性和網絡Excel表格文件以作對應關系。將兩個文件導入Cytoscape3.80軟件，刪除未匹配的節點，以“度”值(degree)大小對各節點進行排序，以顏色深淺和大小注釋度值大小，顏色越深，節點大小越大，代表其與其它節點之間關聯越緊密，建立“成分-靶點-通路”網絡圖。

1.6 基因富集和通路富集分析 將上述篩選出的PPI網絡核心靶標導入DAVID 6.8數據庫中，選擇“OFFICE_GENE_SYMBOL”，“gene list”下選“homo sapiens”即進行KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)通路分析以及GO(Gene Ontology)生物富集分析，對其可能存在的生物過程(Biological Process，BP)、分子功能(Molecular Function，MF)和細胞組分(Cellular Component，CC)進行分析。下載數據文件，將相關性較高的結果使用R語言進行數據可視化。

2 結果

2.1 山豆根抗炎活性成分篩選 通過以“山豆根”為關鍵詞在TCMSP數據庫平臺進行檢索，OB ≥ 30%和DL≥0.18作為篩選條件，最終得到15個潛在活性成分，包括多種生物堿和黃酮類等化合物，其信息見表1。

表1 山豆根抗炎活性成分基本信息

2.2 山豆根抗炎靶點篩選 通過PharmMapper網站得到15個化合物的潛在靶點基因，去除重復后共682個。通過GeneCards數據庫以“Inflammation”進行檢索，得到炎癥疾病靶標共10945個。利用Uniprot數據庫獲取靶點和疾病靶點的標準基因名。將潛在活性成分與靶點相映射，得到山豆根活性成分抗炎潛在靶標共416個(圖1)。

圖1 “疾病-藥物”共有靶點篩選

2.3 GO和KEGG分析及“成分-靶點-通路”網絡可視化 利用DAVID 6.8數據庫，將山豆根抗炎靶基因進行上傳，并限定條件進行GO及KEGG信號通路的富集分析。按P值排序，并篩選確定前10的BP、MF和CC(表2)，利用R語言進行生物信息分析可視化(圖2)，以外圈顏色深淺代表條目置信度，以內圈柱形長短代表富集程度。GO富集分析顯示，共同靶點主要涉及的生物學過程包括對凋亡的負調控、對缺氧的反應和對外源刺激的反應等；主要分布于細胞質、外泌體和細胞胞外等結構中；主要涉及的分子功能過程包括識別蛋白質的結合、蛋白質絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性和絲氨酸型內肽酶活性等(表2)。通過KEGG通路富集分析結果顯示，以P進行排序，山豆根抗炎活性成分涉及的通路可能主要包括Hif-1α、細胞凋亡等信號通路(圖3)。對篩選出的靶點、活性成分以及通路建立“成分-靶點-通路”網絡圖(圖4)。

圖2 GO富集分析主要條目

圖3 KEGG通路富集分析結果

圖4 “藥物-靶點-通路”網絡圖

表2 GO富集分析主要條目

2.4 PPI與拓撲分析結果 將共有靶標導入Cytoscape 3.8.0軟件中，使用內置的CytoNCA軟件進行拓撲分析，以DC，CC和BC為拓撲學指標，各取其排序前10位的結果，取3種拓撲分析方式共有的交集基因作為山豆根治療炎癥的核心靶點(圖5)，包括原癌基因非受體酪氨酸激酶SRC，絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1)、熱休克蛋白90α(heat shock protein 90 alpha，HSP90AA1)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶AKT1和大腸桿菌堿性磷酸酶(E.coli Phosphatase Alkaline，PHOA)。

圖5 拓撲分析結果通路富集分析結果

3 討論

山豆根始載于宋《開寶本草》，“味甘，寒，無毒”；《本草求真》載其為“解咽喉腫痛第一要藥”[14]。最早的本草文獻記載“出廣南”，為廣西和云南的道地藥材，也是山豆根片(口服液)和抗病毒顆粒等40多種中成藥生產的主要原料。自1963年版《中國藥典》首載“廣豆根”以來，此后為歷版藥典收載。此外，山豆根也是喀斯特石漠化貧困山區脫貧致富重要的藥材資源之一。

臨床前研究和臨床實踐中，發現山豆根具有良好的解熱抗炎作用，但其中主要的抗炎效用成分尚不完全明晰。本研究通過網絡藥理學的山豆根抗炎活性成分和潛在靶點分析，共篩選到15個潛在抗炎活性成分，包括苦參堿、槐果堿和異鼠李素等成分，認為是山豆根發揮抗炎效用的主要成分。這些成分主要參與到對凋亡的負調控、對缺氧的反應和對脂多糖的反應等生物學過程中。通路富集結果顯示，HIF-1信號通路、細胞凋亡通路、Ras信號通路和Toll樣受體信號通路等被顯著富集。通過拓撲分析發現，山豆根抗炎活性成分可能主要作用于SRC、MAPK1和Akt1等主要靶點，發揮抗炎作用。

缺氧和炎癥反應關系密切。缺氧誘導因子HIF-1是一種在缺氧狀態下特異性發揮活性的轉錄因子，廣泛存在于哺乳動物和人體內，由α和β兩個亞單位組成的異源二聚體。HIF-1α(HIF1A)具有氧不穩定性的特點。在正常細胞中，HIF-1α通過蛋白酶的脯氨酰羥化和泛素化降解，而缺氧會干擾泛素化過程而使HIF-1α得到積累，繼而HIF-1α遷移到核內與HIF-1β結合，形成復合物啟動下游包括經典炎癥信號NF-κB在內的基因通路表達。研究認為在缺氧條件下巨噬細胞中的HIF-1α水平會升高，進一步加劇巨噬細胞所介導的炎癥反應[15]。過表達HIF-1α會延遲炎癥反應的消退，其機制可能與中性粒細胞凋亡被抑制有關。本研究發現，山豆根抗炎活性成分可能參與到HIF-1信號通路中發揮作用。

酪氨酸蛋白激酶Src，屬于受體型酪氨酸激酶(protein tyrosine kinase，PTK)家族成員，是一類由多種細胞外信號分子激活的蛋白酪氨酸激酶，Src通過磷酸化修飾調控自身活性并向下傳遞信號。Src蛋白激酶是PI3K的活性激動劑，在LPS刺激下，能通過PI3K信號通路增加p47phox活性，刺激NADPH氧化酶產生O2·-；并且抑制Src蛋白激酶磷酸化后，可拮抗LPS介導的巨噬細胞炎癥反應，減少巨噬細胞炎癥因子合成和分泌[16-17]。既往研究發現，異鼠李素(STG1)能通過抑制Src的表達，從而起到緩解結腸炎的作用[18]。也有研究發現，苦參堿(STG12)能通過靶向阻斷Src激酶結構域中Tyr419的自磷酸化，抑制Src激酶活性，進而下調MAPK/ERK信號通路的活化水平，從而抑制癌細胞的過度增殖[19]。MAPK信號通路中包含ERK、JUK和p38等MAPK亞族，MAPK在介導炎癥反應和細胞因子生成中發揮關鍵作用[20]。相關文獻回顧性研究提示，異鼠李素(STG1)能夠調節NF-κB和MAPK等信號通路的激活，調控炎癥相關細胞因子的表達，在多種炎癥性疾病中發揮重要作用[21]?？鄥A(STG12)能夠誘導p38的磷酸化，促進Nrf-2的入核，提高HO-1/NADPH的表達水平，在體內和體外抑制細胞內活性氧的產生并抑制內皮細胞凋亡，并且該效應能被MAPK抑制劑所阻斷，提示苦參堿至少部分通過MAPK通路發揮抗內皮細胞凋亡作用[22]。蛋白激酶B PKB也稱Akt，哺乳動物細胞表達3種Akt亞型(Akt1、Akt2和Akt3)，Akt1在心血管系統中調節多種功能，在血管生成、細胞凋亡和心肌肥大的調節中發揮重要作用[23]。在ApoE-/-小鼠上，Akt1基因的缺失會導致更嚴重的動脈粥樣硬化病變，包括血管狹窄，纖維帽變薄，更嚴重的炎癥反應等[24]。槲皮素(STG15)能夠抑制TGF-β1/Smads和Akt信號激活，減弱肝星狀細胞活化，抑制CCl4誘導的大鼠肝纖維化從而減輕肝損傷[25]。

基于相關文獻回顧性研究提示和思考，結合本研究結果分析認為，未來進一步明確山豆根抗炎和其他藥理效用的關鍵，應充分融合包括藥劑學和藥代動力學等不同學科特點，辨析不同屬地山豆根的藥理活性與其中各物質的量-效關系，考察各物質之間是否存在協同作用，以整體觀解析山豆根中不限于此研究中篩選出的各物質對疾病的干預效果。本研究一定程度上揭示了山豆根能通過多靶點、多途徑共同調控炎癥的物質基礎和可能的作用機制，為其臨床合理運用以及相關藥物研發等提供了相應理論基礎和科學依據。