小兒哮喘巴布劑組方藥材提取與精制工藝研究*

錢桂英，畢肖林，錢云英，吳曉明△

（1.南京中醫藥大學常熟附屬醫院，江蘇 常熟 215500；2.南京中醫藥大學藥學院，江蘇 南京 210023）

中醫藥治療哮喘具有獨特優勢［1-3］。巴布劑載藥量大，適用于單次大劑量給藥，同時不含傳統膏藥所特有的黃丹、香油等物質，不會引發鉛中毒、皮膚過敏等不良反應，應用廣泛。小兒哮喘方為我院經驗方，有宣肺化飲、瀉肺袪痰、止咳平喘之效，臨床運用多年，收效良好。為進一步優化劑型，方便患兒使用，本研究中對該方開展藥材提取、精制工藝研究，確定相關參數，在保證有效成分得率的前提下，最終獲得藥物提取物，為后續中藥復方制劑小兒哮喘巴布劑的制備提供基礎。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

ATY124型分析天平、LC-2010AHT型液相色譜儀（日本Shimadzu公司）；KH-500B 4L型超聲波清洗機（昆山禾創超聲儀器有限公司）；SHB-ⅢS型真空泵（鄭州長城科工貿有限公司）；水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）；RE-5299型旋轉蒸發儀（上海標和儀器有限公司）。

1.2 試藥

芥子堿硫氰酸鹽對照品、6-姜酚對照品、細辛脂素對照品（南京金益柏生物科技有限公司，批號分別為JBZ-0585，JBZ-0561，JBZ-1319，含量均大于98%）；生姜購于農貿市場，經南京中醫藥大學巢建國教授鑒定為姜科植物姜的根莖。乙腈、甲醇均為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。細辛飲片（產地遼寧，批號為200609）、白芥子（產地江蘇，批號為200718），制白附子飲片、花椒（產地四川，批號分別為200307，200411），均購自蘇州天靈中藥飲片有限公司。

2 方法與結果

2.1 含量測定

2.1.1 回流提取

色譜條件：色譜柱為Kromasil 100-5-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈（A）-0.08 mol/L磷酸二氫鉀水溶液（B），梯度洗脫（0～19 min時12%A，19～20 min時12%A→52%A，20～48 min時52%A→56%A，48～50 min時56%A→12%A，50～60 min時12%A）；流速為1.0 mL/min；檢測波長為286 nm（6-姜酚、細辛脂素）和326 nm（芥子堿硫氰酸鹽）；柱溫為30℃；進樣量為20 μL［4］。

溶液制備：取6-姜酚對照品適量，精密稱定，加甲醇超聲（功率500 W，頻率40 kHz，下同）溶解，制得質量濃度為0.954 mg/mL的對照品貯備液，精密吸取0.5 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋制得質量濃度為0.047 7 mg/mL的6-姜酚對照品溶液；取芥子堿硫氰酸鹽對照品適量，精密稱定，加70%甲醇超聲溶解，制得質量濃度為0.992 mg/mL的對照品貯備液，精密吸取1 mL，置5 mL容量瓶中，加乙腈-0.08 mol/L磷酸二氫鉀溶液（10∶90，V/V）定容，制得質量濃度為0.198 4 mg/mL的芥子堿硫氰酸鹽對照品溶液［5］；取細辛脂素對照品適量，精密稱定，加甲醇超聲溶解制得質量濃度為1.403 mg/mL的對照品貯備液，精密吸取0.5 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋，制得質量濃度為0.070 15 mg/mL的細辛脂素對照品溶液。取提取液0.1 g，精密稱定，置10 mL容量瓶中，加70%甲醇超聲處理20 min，取2 mL，離心，經0.45 μm濾膜濾過，取續濾液，得供試品溶液。

系統適用性試驗：分別吸取上述3種對照品溶液及供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應位置有吸收峰。理論板數按芥子堿硫氰酸鹽、6-姜酚、細辛脂素計均應不低于3 000，分離度均大于1.5，基線分離良好。詳見圖1。

圖1 高效液相色譜圖1.Sinapine thiocyanate 2.6-Gingerol 3.AsarininA.Sinapine thiocyanate reference solution B.6-Gingerol reference solution C.Asarinin reference solution D.Test solutionFig.1 HPLC chromatograms

線性關系考察：取上述3種對照品貯備液各1 mL，加甲醇逐級倍比稀釋，按擬訂色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以峰面積（X）為橫坐標、待測成分質量濃度為縱坐標（Y，μg/mL）進行線性回歸，回歸方程及線性范圍見表1。

表1 線性關系考察結果（n=8）Tab.1 Results of the linear relation test（n=8）

精密度、穩定性、重復性試驗：按相關規定進行相應試驗。3種試驗結果的RSD均小于3.0%，表明儀器精密度良好，供試品溶液在室溫下放置12 h內基本穩定，方法重復性良好。

2.1.2 醇沉提取

色譜條件：同2.1.1項。

在外企工作的小趙看到《暫行辦法》后也很高興，“我每月收入近2萬元，從2019年起可以少繳近千元稅?！毙≮w是獨生子女，有一個4歲的女兒，父母都年滿60歲，租房居住，業余時間還在進修MBA。根據新規定，2萬元的收入減“三險一金”4000元，子女教育專項附加扣除1000元，贍養老人專項附加扣除2000元，住房租金專項附加扣除1500元，繼續教育專項附加扣除400元，如此計算，小趙每月應繳納的稅款降為600元，而2018年11月前他每月要繳1590元個稅。

溶液制備：各對照品溶液制備同2.1.1項。提取液采用不同體積分數的乙醇進行醇沉、冷藏靜置后，將上清液減壓濃縮，回收乙醇。分別取濃縮后的濾液1～10 mL置50 mL容量瓶，加甲醇定容，搖勻，離心，經0.45 μm濾膜濾過，取續濾液，即得供試品溶液。

精密度、穩定性、重復性試驗：按相關規定進行相應試驗。3種試驗結果的RSD均小于3.0%，表明儀器精密度良好，供試品溶液在室溫下放置12 h內基本穩定，方法重復性良好。

2.2 揮發油提取工藝研究

2.2.1 揮發油提取

采用水蒸氣蒸餾法。取20%處方量的生姜片200 g、花椒粗粉20 g及細辛粗粉12 g，分別加水浸泡0.5 h，生姜、花椒采用輕油提取器，細辛采用重油提取器，回流提取，靜置過夜，讀取揮發油體積［4-8］。

2.2.2 單因素考察

以所得揮發油體積為考察指標，分別對提取時間和加水量進行單因素考察。固定加水量為8倍，提取時間為2，4，5，6，7，8 h時，生姜+花椒揮發油提取量分別為0.25，0.30，0.40，0.40，0.35，0.40 mL，細辛揮發油提取量分別為1.05，0.90，1.00，1.20，0.80，1.00 mL；固定提取時間為5 h，加水量為6，8，10，15倍時，生姜+花椒揮發油提取量分別為0.33，0.40，0.40，0.40 mL；固定提取時間為6 h，加水量為6，8，10倍時，細辛揮發油提取量分別為0.50，1.20，0.73 mL。故初步確定生姜和花椒加8倍量水、提取5 h，細辛加8倍量水、提取6 h。水提液合并后備用。

2.3 提取液得率及綜合評分

綜合評分：回流提取時，根據芥子堿硫氰酸鹽、6-姜酚、細辛脂素含量計算，綜合評分=芥子堿硫氰酸鹽得分×0.3+6-姜酚得分×0.3+細辛脂素得分×0.3+提取液得率得分×0.1，其中芥子堿硫氰酸鹽、6-姜酚、細辛脂素得分分別為各自含量/各自最大含量×100；醇沉提取時，根據芥子堿硫氰酸鹽、6-姜酚含量計算，綜合評分=芥子堿硫氰酸鹽得分×0.5+6-姜酚得分×0.5。

2.4 正交試驗優化

2.4.1 回流提取工藝

以水蒸氣蒸餾法提取所剩藥渣及白芥子、制白附子混合物為考察對象。根據預試驗結果，以乙醇體積分數（因素A）、提取次數（因素B）、加水量（因素C）、提取時間（因素D）為考察因素，綜合評分為評價指標，采用L9（34）正交試驗法，因素水平見表2，試驗結果見表3，方差分析結果見表4。由表3可見，各因素對考察指標的影響［10］強度大小依次為B＞A＞D＞C；由表4可見，4種因素對試驗結果均無顯著影響。結合K值確定最優工藝為A2B3C3D3，即以70%乙醇回流提取3次，每次加10倍量水，提取60 min。

表2 回流提取工藝因素水平Tab.2 Factors and levels of reflux extraction process

表3 回流提取工藝L（934）正交試驗設計及結果（n=9）Tab.3 Design and results of the L9（34）orthogonal test of reflux extraction process（n=9）

表4 回流提取工藝方差分析結果Tab.4 ANOVA results of reflux extraction process

2.4.2 醇沉提取工藝

以水蒸氣蒸餾法提取后的水提液為考察對象，根據預試驗結果，以濃縮程度（藥材、藥液體積比，因素E）、乙醇體積分數（因素F）、靜置時間（因素G）為考察因素，綜合評分為評價指標，采用L9（34）正交試驗法，因素水平見表5，試驗結果見表6，方差分析結果見表7。由表6可見，各因素對考察指標的影響強度大小依次為G＞F＞E，由表7可見，3種因素對試驗結果均無顯著影響，結合K值確定最佳工藝為E2F2G3，即濃縮至藥材、藥液體積比為1∶1.5，加60%乙醇，靜置48 h。

表5 醇沉提取工藝因素水平Tab.5 Factors and levels of alcohol precipitation process

表6 醇沉提取工藝L（934）正交試驗設計及結果（n=9）Tab.6 Design and results of the L9（34）orthogonal test of alcohol precipitation process（n=9）

表7 醇沉提取工藝方差分析結果Tab.7 ANOVA results of alcohol precipitation process

2.5 驗證試驗

按優選的最佳工藝進行試驗，結果芥子堿硫氰酸鹽含量為1.521 1 mg/mL，6-姜酚含量為0.236 5 mg/mL。

3 討論

3.1 巴布劑特點

中藥巴布劑是指水或醇提取的中藥浸膏、超微粒粉碎的中藥粉體、浸泡后的中藥藥泥與巴布劑基質混合均勻后加工而成的巴布劑［11］。

巴布劑為藥材提取物、藥材或化學藥物與適宜親水性基質混合后涂布于背襯材料制成的貼膏劑［12］，由背襯（常用無紡布、彈力布）、膏體、隔離膜組成，并分為保護層、儲藥層、支持層。保護層為一層聚酯保護膜，使用前揭去；儲藥層即基質和主藥部分，為水分子和藥物組成的一層水溶性高分子框架結構；支持層即背襯層，為一層流通性強的無紡布，為膏體載體，起支撐作用。在此結構下，小分子藥物可沿濃度梯度滲入皮膚發揮作用。

3.2 揮發油提取工藝優化

生姜、花椒、細辛等均含揮發油［13-15］，本研究中先根據既往研究初步確定各揮發油的提取工藝參數，并查閱2020年版《中國藥典（一部）》，依據生姜、花椒揮發油密度遠小于1，采用輕油提取器提取生姜片和花椒粗粉；而細辛揮發油密度與1相近，試驗過程中，由于揮發油呈水油混合狀態，各組分揮發時的溫度不同，沸點低的先揮發，密度通常較小，易漂浮于水面；而沸點高的成分易發生沉降現象。綜合分別通過兩種提取器提取細辛揮發油得出的試驗數據，最終采用重油提取器提取細辛粗粉。以揮發油提取量為考察指標，采用單因素試驗法考察不同加水量、不同提取時間對揮發油提取量的直接影響，得出最佳的揮發油提取條件為，生姜和花椒加8倍量水、提取5 h，細辛加8倍量水，提取6 h。

3.3 藥渣中殘留活性成分提取工藝優化

藥材經提取后，藥渣中仍有活性成分殘留，因而將水蒸氣蒸餾提取后的藥渣和白芥子、制白附子混合后再進行提取，該藥渣主要有效成分為脂溶性成分，因此采用乙醇溶液作為提取溶劑［16-17］。預試驗結果顯示，影響藥渣和其他藥材再提取的因素有乙醇體積分數、提取次數、加水量及提取時間，故以上述4種因素為考察因素，綜合評分為考察指標進行L9（34）正交試驗，根據試驗及方差分析結果，確定最優工藝。提取后將藥渣與其他粗粉混勻后進行醇提，再次進行L9（34）正交試驗，成功確定了藥材再提取工藝條件。驗證試驗結果表明，該優選工藝可行。

3.4 醇沉提取工藝優化

藥材經水蒸氣蒸餾法提取后，提液中存在部分大分子親水性雜質，其難溶于乙醇溶液，為進一步除去雜質，采用醇沉法進行精制，將水提液和適量乙醇混合，冷藏靜置后可沉淀這類雜質，并通過抽濾的方式除去［18］。提取后的水提液繼續精制，采用正交試驗法考察。因本試驗中采用水蒸氣蒸餾法，考慮細辛脂素為脂溶性物質，含量較少，故醇沉提取工藝中未考察其含量。根據預試驗結果，選擇濃縮程度（藥材、藥液體積比）、乙醇體積分數、靜置時間為考察因素，綜合評分為考察指標，行L9（34）正交試驗，確定最佳醇沉提取工藝。驗證試驗結果表明，該優選工藝可行。

3.5 方法評價

近10年來，哮喘診治方法的更新相對緩慢［19］。目前，兒童哮喘治療目標是盡量減少癥狀負擔（日常癥狀、睡眠不安和活動受限）和哮喘不良后果的風險（惡化、持續氣流受限和藥物副作用）［20］。而全球哮喘管理和預防戰略（GINA）對哮喘患者藥物治療的主要區別仍在于類固醇、β受體激動劑或白三烯拮抗劑的選擇及藥物劑量的不同優先級。這種治療方法存在3%～10%的“無反應者”［21］。同時，兒童使用吸入性糖皮質激素存在長期副作用的潛在風險，如腎上腺功能衰竭、傷口愈合延遲、體質量增加、骨質疏松、白內障和發育遲緩等［22］。

當前中藥巴布劑應用前景廣闊，潛力較大，但限制因素較多，主要包括：可供使用的國產輔料品類較少；缺乏標準化的大型生產設備；中藥多為復方，成分復雜，制備工藝難度大；缺乏統一、科學的制劑質量檢測指標和方法［23］。本研究所建制劑藥材提取工藝可為小兒哮喘巴布劑的制備提供基礎數據。