大口黑鱸源殺魚愛德華氏菌的鑒定及組織病理學觀察

■ 王凱 阮鵬飛（ 江門市澳保生物科技有限公司 ； 江門市動物疫病預防控制中心 ）

圖1 患病大口黑鱸體表病癥

圖2 患病大口黑鱸內臟解剖圖（a、頭腎；b、后腎；c、心臟；d、肝臟；e、脾臟；f、果凍狀黃色腹水）

大口黑鱸（Micropterus salmoide），俗稱加州鱸。屬于鱸形目、鱸亞目、太陽魚科，是一種純淡水的廣溫性肉食性魚類。原產于北美洲的淡水水域，后引入英國、法國、西非、巴西、菲律賓等國及我國香港、臺灣等地區養殖，其養殖水域幾乎遍布全球。20世紀80年代初引入我國內地，現已推廣到全國許多省市，成為我國特種水產品之一。近年來，由于養殖密度的不斷擴大，病害問題不斷增多，其中，作為引起人類感染的重要人畜共患病原微生物，愛德華氏菌是魚類中最重要的細菌性疾病之一，困擾著全球水產養殖業，在淡水魚類養殖中引起敗血癥和巨大的經濟損失。

愛德華氏菌屬腸桿菌科，2012年以前，世界公認的愛德華氏菌屬分為三個種，包括遲緩愛德華氏菌（Edwardsiella tarda, E.tarda）、保科愛德華氏菌（EdwardsiellaHoshinae, E.hoshinae）和鮰愛德華氏菌（Edwardsiella ictalurid, E.ictaluri），其中，分布和宿主范圍較廣的是遲緩愛德華氏菌，由于遲緩愛德華氏菌的不同來源的分離株在表型和遺傳特征方面存在著很多的差異，自2013年Abayneh等人的研究將異于遲緩愛德華氏菌的分離株重新命名為殺魚愛德華氏菌（Edwardsiella piscicida），殺魚愛德華氏菌呈全球性地理分布，宿主范圍也十分廣泛，多為海水和咸淡水魚類，包括加州鱸、尖吻鱸、白鮭魚、歐洲鰻鱺、真鯛、斑點叉尾鮰、大菱鲆和黑斑刺魟等，給相關養殖產業造成了巨大的經濟損失。因此，通過對該屬細菌的研究，優化診斷方法，提升防控效率，對水產養殖業有著十分重要的意義。

本研究以廣東省佛山市杏壇鎮區域養殖塘發病大口黑鱸的細菌性病原體為研究對象。通過對菌株進行分離純化，觀察形態；將分離純化的菌株進行菌種鑒定；以及制作組織印片，觀察各組織中細菌的形態及分布情況；通過組織切片，觀察各組織的病變；結合藥敏實驗結果，記錄病原菌對各種抗生素的敏感性。文中描述了大口黑鱸感染愛德華氏菌后引起的癥狀，為大口黑鱸養殖業提供更多的病害預防及診斷思路；通過分析藥敏實驗結果，初步判斷愛德華氏菌的敏感抗生素藥物，為大口黑鱸養殖業提供更多的病害防控策略，本文中的藥敏實驗結果僅對本次采樣的大口黑鱸病魚，針對不同的塘養殖的大口黑鱸感染愛德華氏菌后，應再次進行藥敏實驗，分析敏感藥物。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

腦心浸出液培養基（BHI）和革蘭氏染色液購自環凱微生物，藥敏紙片購自杭州微生物試劑有限公司，超白吸附載玻片和蓋玻片購自江蘇世泰實驗器材有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品采集和病原分離及鑒定

2021年11～12月，對廣東省佛山市杏壇鎮區域養殖塘大口黑鱸自然發病病樣進行多次采樣，對發病情況、病理特征等進行檢測。采用平板劃線法，在BHI 固體培養基上對瀕死的患病大口黑鱸的后腎、脾臟和皮下膿腫等進行接種培養，置于28℃生化培養箱中過夜培養。選擇呈優勢生長的單菌落，在BHI 固體培養基上進行純化分離，從而得到單菌落，挑取單菌落進行革蘭氏染色。將純化分離的含有單菌落的平板送至鑒定公司進行菌種鑒定。

將菌株的16s rDNA基因擴增序列通過NCBI（National Center for Biotechnology Information）進行同源性分析，選取相關性較高的16s rDNA序列使用Clustal W進行多序列比對分析，使用MEGA5.0軟件中的鄰接法（Neighbor Joining method）構建系統發育樹。

1.2.2 組織印片

對采集樣品的肝臟、脾臟、腎臟和血液進行涂片，干燥后進行瑞氏-吉姆薩染色，在載玻片上均勻滴加瑞氏染液1mL，染色1min，然后在瑞氏染色液中均勻滴加吉姆薩染色液3mL，染色20min。染色完成后，用蒸餾水將染色液沖洗干凈，繼續沖洗至染色區域為淡紫色，注意不要直接沖洗染色部分，干燥后在100倍油鏡下觀察細菌形態。

1.2.3 組織切片

將病魚的心臟、肝臟、脾臟和腎臟組織切塊使用4%多聚甲醛溶液進行固定，固定1h后更換一次4%多聚甲醛溶液，寄出進行組織切片制作。

1.2.4 藥敏實驗

挑選分離純化的單菌落置于BHI液體培養基中進行擴培，28℃下搖床培養24h，吸取100μl菌液滴加在BHI固體培養基上，均勻涂布，將藥敏片貼于培養基上，放入28℃培養箱中培養24h，觀察測量抑菌圈大小并判定結果。

1.2.5 人工回感實驗

隨機采取 3尾購自廣東佛山某水產養殖場的健康大口黑鱸，取其內臟組織進行研磨，在BHI平板上進行涂布，培養24h后無優勢菌生長。再購12尾大口黑鱸暫養3d后進行人工感染實驗，人工感染實驗分為兩組，實驗組：取已確定健康無病的加州鱸6尾，使用無菌水將本文分離的菌種濃度調整成106，每尾魚注射0.5mL的菌液。對照組：取同樣的6尾魚，每尾魚注射等量的無菌水，感染期間每天記錄各組魚的癥狀及死亡情況，并對瀕死的魚進行解剖觀察和分離細菌。

2 結果

2.1 發病病例臨床癥狀

發病大口黑鱸主要為1齡大口黑鱸，觀察病魚體表，發現體表血點，爛鰓，眼球突出，黃身，解剖后可見果凍狀或血樣腹水，心臟糜爛，心膜炎，尾柄皮下膿腫，頭腎、后腎腫大，空胃，脾臟腫大充血，脾臟大量白點，肝臟腫大，豆腐肝的癥狀。

2.2 細菌分離及鑒定

通過平板劃線對病魚組織中的細菌進行粗分，28℃培養24h后，平板上長出優勢菌，將優勢菌劃線，進行純化分離，置于28℃培養24h后，獲得單一菌種，菌種在BHI培養基上形成的菌落特征為圓形不透明、淡黃色、表面濕潤光滑、邊緣整齊（圖3，b），革蘭氏染色結果系顯示該菌為革蘭氏陰性菌（圖3，c）。將單一菌種平板寄出進行鑒定，進行16s rDNA測序，將測序所得序列在NCBI數據庫上進行比對，比對結果該菌與殺魚愛德華氏菌一致性達99.19%，并將該菌株命名為PB-025。

圖3 菌株的生長情況和染色形態（a、后腎及脾臟菌種粗分離；b、純化后菌落的生長形態；c、菌種革蘭氏染色呈陰性[紅色]）

利用MEGA5.0軟件采用鄰接法（Neighbor Joining method）構建的系統發育樹結果顯示（圖4），菌株PB-025與殺魚愛德華氏菌（Edwardella piscicida）聚為一支。

圖4 基于菌株PB-025 16s rDNA序列的系統發育樹

圖5 愛德華氏菌在各組織中的分布(a、肝臟中的愛德華氏菌；b、脾臟中的愛德華氏菌；c、腎臟中的愛德華氏菌；d、血液中的愛德華氏菌；標尺為20μm)

2.3 組織印片

對患病大口黑鱸的肝臟、脾臟、腎臟和血液進行瑞氏-吉姆薩染色，染色后能夠很好的觀察到各組織中的殺魚愛德華氏菌的分布情況，可見在肝臟、脾臟、腎臟和血液中均有游離或吞噬的愛德華氏菌，細菌長約3～5μm。

2.4 組織切片

從組織切片結果中可得，在心膜的致密層中明顯可見大量的愛德華氏菌（圖6，a），且愛德華氏菌感染會引起心膜炎，導致心臟外膜變厚，以及心臟海綿層中會形成肉芽腫結構（圖6，b）；脾臟造血區域一直是受影響最嚴重的組織，脾臟中可見大量的肉芽腫結構（圖6，c）；腎臟中包含多灶性到合并的肉芽腫（圖6，d）；病變在肝臟中不算嚴重，但也可見少量的凝固性壞死灶（圖6，e）。肉芽腫性炎癥、壞死灶和細菌的可變組合是感染愛德華氏菌病樣組織中常見的組織病理癥狀。

圖6 自然感染的大口黑鱸中愛德華氏菌相關病變的顯微照片(a、b：心臟的病變，a：標尺為20μm，b：標尺為200μm；c：脾臟的病變，標尺為500μm；d：腎臟的病變，標尺為100μm；e：肝臟的病變，標尺為200μm)

2.5 藥敏實驗

將擴培的愛德華氏菌進行藥敏實驗，結果如表1所示：PB-025菌株對鹽酸多西環素、硫酸新霉素、氟苯尼考、環丙沙星、左氧氟沙星、氧氟沙星、丁胺卡那、諾氟沙星、卡那霉素和四環素呈現高度敏感，對恩諾沙星、頭孢拉定、阿奇霉素、鏈霉素和慶大霉素呈現中度敏感，對阿莫西林和紅霉素呈現低度敏感，對復方新諾明和青霉素具有耐藥性。該結果與加州鱸遲緩愛德華氏菌的敏感性藥物存在一定的一致性。

表1 各藥物的抑菌圈信息

2.6 人工回感實驗

健康無病的大口黑鱸在感染第5d后開始出現死亡，發病病癥與自然發病的魚存在相似性，18d內累計死亡率為100%，而對照組在實驗期間未出現死亡情況（圖7），實驗結果說明本文分離的菌株PB-025具有較強的致病力。且從人工感染的大口黑鱸組織中再次分離致病菌，菌落形態及革蘭氏染色與自然發病的病原菌的一致，結果表明本文從自然發病的大口黑鱸所分離的細菌為此次發病的致病菌。

圖7 菌株PB-025的人工感染實驗

3 討論

目前，對于魚類愛德華氏菌的理化特性、致病機制以及防控手段都有相關研究，其中，防控手段尤為重要，有研究表明可通過免疫預防手段防控愛德華氏菌，抗E.tarda的單抗可以顯著提高牙鲆抵抗愛德華氏菌的能力，延長存活時間；有研究研制出遲緩愛德華氏菌的滅活疫苗，能夠對大菱鲆愛德華氏菌病起到重要的保護作用，能夠有效抵御遲緩愛德華氏菌的強毒株；也有研究研制出針對感染遲緩愛德華氏菌的羅非魚的菌蛻疫苗，實驗結果表明該疫苗有較高的免疫保護率。

由于殺魚愛德華氏菌是自2013年遲緩愛德華氏菌區別開來，因此對殺魚愛德華氏菌的相關研究還相對較少，其中，有研究報道了在患病烏鱧中檢測到了殺魚愛德華氏菌，并對該菌株進行了藥敏實驗，有研究為構建養殖大菱鲆殺魚愛德華氏菌快速檢測模型提供了思路，也有研究報道了斑馬魚和草魚組蛋白核苷酸的多態性在殺魚愛德華氏菌感染中的作用，篩選出了能增強魚類免疫力及對殺魚愛德華氏菌的抗病力的抗菌組蛋白，同時也有研究構建了殺魚愛德華氏菌的 Δcrp 疫苗候選株，但僅有這些研究是遠遠不夠的，為了防控殺魚愛德華氏菌給魚類帶來的危害，減少魚類養殖過程中的經濟損失，應當重視在養殖過程中遇到的殺魚愛德華氏菌感染。本研究采用的瑞氏-吉姆薩染色法能夠快速簡便的對殺魚愛德華氏菌進行初步鑒定，并通過藥敏實驗進行精準用藥獲得了成功，本次研究也驗證了使用吉姆薩染色劑可以更好地觀察細菌的研究。

首先養殖環境的好壞與養殖魚類的健康息息相關，也是防控愛德華氏菌病的關鍵因素。關于保持良好的養殖環境有幾點建議：1、保持良好的水質，定期使用環境友好的益生菌制劑產品，達到藻相平衡、穩水肥水的效果；2、定期改底凈水，達到分解底部殘餌糞便及有機污染物，降解毒素，抑制病原菌、寄生蟲的滋生，降低養殖環境進一步惡化的風險；3、定期消毒與內服保健，抑制有害菌生長，提高養殖動物自身免疫力的同時促進魚體傷口恢復；4、根據養殖病害“三環”理論做好全面防御。

同時養殖密度也十分關鍵，適當的養殖密度、科學飼喂，能明顯降低細菌性疾病的發生率。定期拌喂中草藥類、維生素類、保肝護肝類、提高免疫力類的產品，可增強體質，提高養殖動物自身免疫力，減少應激；另外要加強管理，在投放魚苗前做好魚塘的清塘和消毒工作，并避免混養不同生長階段的魚，其次對病原菌的出現進行密切監控也是防控的有效方法。

最后，在魚類發生細菌性病害時，應針對病癥尋找真正原因，做到有效、精準用藥。在預防與治療的同時，避免濫用藥物導致環境惡化、病原菌耐藥性產生，而給養殖埋下更大的隱患。 （參考文獻略）