高遷移率族蛋白B1對人支氣管上皮細(xì)胞的炎癥因子和受體表達(dá)的影響

梁 悅 薛艷龍 楊超勉 黃天霞 陳一強(qiáng)

1.南寧市第一人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，廣西南寧 530028；2.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 廣西醫(yī)科大學(xué)呼吸疾病研究所，廣西南寧 530021

高遷移率族蛋白B 1（high-mobility group box 1，HMGB1）是廣泛存在于幾乎所有細(xì)胞類型的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中的一種高度保守蛋白，它可以調(diào)控多種炎癥反應(yīng)[1]。已有相關(guān)研究證明HMGB1參與了氣道慢性炎癥性疾病的發(fā)病，如在支氣管哮喘（簡稱“哮喘”）患者血清中，HMGB1表達(dá)水平較健康人群明顯升高[2]。但HMGB1參與哮喘炎癥反應(yīng)的機(jī)制還有待進(jìn)一步探討。

哮喘是一種常見的氣道慢性炎癥性疾病，因不同的臨床特征和體內(nèi)不同的分子機(jī)制而表現(xiàn)出發(fā)病的異質(zhì)性[3]。其中支氣管上皮細(xì)胞（16-HBE）是近年來機(jī)制研究的重點(diǎn)[4]，它參與哮喘氣道炎癥反應(yīng)機(jī)制不明。有研究表明16-HBE可釋放白介素-8（interleukin-8，IL-8）等多種炎癥因子[5]，且16-HBE存在多種HMGB1相關(guān)受體[6]。因此本研究通過建立體外細(xì)胞模型，研究HMGB1對16-HBE釋放炎癥因子和受體表達(dá)的影響，以證實(shí)HMGB1是否可能通過干預(yù)這一途徑來參與哮喘氣道炎癥的發(fā)生。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

實(shí)驗(yàn)所用16-HBE購自歐洲標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞收藏中心（ECACC）。

1.2 實(shí)驗(yàn)主要儀器和試劑

Mutiskan酶標(biāo)儀（美國 Thermo），Western blot設(shè)備（美國Bio-Rad），Odyssey雙色紅外熒光成像系統(tǒng)（美國 Licor），重組型 HMGB1（美國 Sigma，批號：H4653），IL-8、基質(zhì)金屬蛋白酶 -9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）、胸 腺 基 質(zhì) 淋 巴 生成 素（thymic stromal lymphopoietin，TSLP）、血 管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）Human酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)法（ELISA）試劑盒（武漢博士德，批號：EK0413、EK0465、EK0958、EK0539），高級糖基化終產(chǎn)物受體（receptor for advanced glycation end products，RAGE）、Toll樣受體 2（toll-like receptor 2，TLR2）、Toll樣受體 4（toll-like receptor 4，TLR4）抗體（美國GeneTex，批號：821904539、821904830、821403584），IRDye800CWIgG熒光羊抗兔二抗（美國Licor，批號：926-32211）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 HMGB1對16-HBE釋放炎癥因子和受體的影響 將細(xì)胞放入含15%胎牛血清的1640培養(yǎng)基中并置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)、傳代。細(xì)胞按隨機(jī)數(shù)表法設(shè)置為對照組a（不含HMGB1的培養(yǎng)基）、HMGB1-100 ng/ml組、HMGB1-500 ng/ml組、HMGB1-2000 ng/ml組a[7]，培養(yǎng)上述分組細(xì)胞48 h。分別收集以上分組細(xì)胞的培養(yǎng)上清和細(xì)胞裂解液。采用ELISA檢測16-HBE中IL-8、MMP-9、TSLP、VEGF的釋放水平，用蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測細(xì)胞裂解液中RAGE、TLR2、TLR4蛋白水平。

1.3.2 受體活化和炎癥因子表達(dá)之間的關(guān)系 根據(jù)第一階段實(shí)驗(yàn)可確定HMGB1增加表達(dá)的受體。按照上述培養(yǎng)傳代方法處理16-HBE后，將細(xì)胞按隨機(jī)數(shù)表法設(shè)置對照組b（不含HMGB1的培養(yǎng)基）、HMGB1-2000 ng/ml組b、RAGE 拮抗組（anti-RAGE組）、anti-RAGE+HMGB1-2000 ng/ml組[8]，培養(yǎng)上述分組細(xì)胞48 h。分別收集以上分組細(xì)胞的培養(yǎng)上清。用ELISA檢測細(xì)胞上清中IL-8、MMP-9、TSLP、VEGF的釋放水平。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 16.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行處理，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），各組間多重比較方差齊性時采用LSD-t檢驗(yàn)，方差不齊時采用Dunnett’s T3法檢驗(yàn)，P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HMGB1對16-HBE釋放IL-8、MMP-9、TSLP、VEGF的影響

與 對 照 組a比 較，HMGB1-500 ng/ml組 和HMGB1-2000 ng/ml組a顯著增加16-HBE的IL-8、MMP-9、TSLP、VEGF釋放，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05）。見表1。

表1 HMGB1對16-HBE釋放IL-8、MMP-9、TSLP、VEGF的影響（pg/ml，n=4，±s）

表1 HMGB1對16-HBE釋放IL-8、MMP-9、TSLP、VEGF的影響（pg/ml，n=4，±s）

注 與對照組a比較，*P ＞ 0.05，**P ＜ 0.05；IL-8：白介素-8；MMP-9：基質(zhì)金屬蛋白酶-9；TSLP：胸腺基質(zhì)淋巴生成素；VEGF：血管內(nèi)皮生長因子

組別 IL-8 MMP-9 TSLP VEGF對照組a 141.915±10.615 244.542±6.061 24.089±2.861 211.812±6.105 HMGB1-100 ng/ml組 155.284±3.002* 250.366±7.930* 34.113±2.407* 225.453±5.697*HMGB1-500 ng/ml組 233.633±10.453** 405.304±8.443** 82.698±14.150** 356.607±7.081**HMGB1-2000 ng/ml組 a 280.413±6.450** 508.745±8.747** 121.344±10.733** 462.833±8.237**F值 142.792 472.843 453.872 450.603 P值 0.000 0.000 0.000 0.000

2.2 HMGB1對16-HBE的RAGE、TLR2、TLR4受體蛋白表達(dá)的影響

與對照組a比較，HMGB1各濃度干預(yù)組不能增加TLR2、TLR4蛋白的表達(dá)，HMGB1-500 ng/ml組和HMGB1-2000 ng/ml組a明顯增加16-HBE的RAGE蛋白表達(dá)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05）。見圖1，表2。

表2 HMGB1對16-HBE的RAGE、TLR2、TLR4蛋白表達(dá)的影響（n=4，±s）

表2 HMGB1對16-HBE的RAGE、TLR2、TLR4蛋白表達(dá)的影響（n=4，±s）

注 與對照組 a比較，*P ＞ 0.05，**P ＜ 0.05；RAGE：高級糖基化終產(chǎn)物受體；TLR2：Toll樣受體2；TLR4：Toll樣受體4

組別 RAGE TLR2 TLR4對照組a 0.533±0.046 0.547±0.0600.023±0.003 HMGB1-100 ng/ml組 0.538±0.048*0.562±0.0380.025±0.005 HMGB1-500 ng/ml組 0.925±0.054**0.569±0.0500.023±0.006 HMGB1-2000 ng/ml組 a 2.130±0.138**0.583±0.0110.027±0.004 F值 496.433 1.757 0.857 P值 0.000 0.188 0.479

圖1 不同濃度HMGB1對16-HBE的RAGE、TLR2、TLR4蛋白表達(dá)的影響

2.3 拮抗RAGE受體后HMGB1對16-HBE的IL-8、MMP-9、TSLP、VEGF釋放影響

與 HMGB1-2000 ng/ml組b比較，anti-RAGE+HMGB1-2000 ng/ml組能明顯減少16-HBE的IL-8、TSLP、MMP-9、VEGF釋放，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05）。顯示HMGB1可依賴RAGE增加16-HBE的 IL-8、MMP-9、TSLP、VEGF 釋放。見表3。

表3 拮抗RAGE受體后HMGB1對16-HBE的IL-8、MMP-9、TSLP、VEGF釋放的影響（pg/ml，n=4，±s）

表3 拮抗RAGE受體后HMGB1對16-HBE的IL-8、MMP-9、TSLP、VEGF釋放的影響（pg/ml，n=4，±s）

注 與HMGB1-2000 ng/ml組b比較，**P ＜ 0.05；IL-8：白介素-8；MMP-9：基質(zhì)金屬蛋白酶-9；TSLP：胸腺基質(zhì)淋巴生成素；VEGF：血管內(nèi)皮生長因子

組別 IL-8 MMP-9 TSLP VEGF對照組b 145.023±7.135 241.453±7.925 25.270±5.279 215.519±6.914 HMGB1-2000 ng/ml組 b 284.442±6.133 504.075±12.405 120.592±9.349 456.742±10.088 anti-RAGE 組 156.034±6.856 249.120±5.817 30.319±4.067 219.572±4.752 anti-RAGE+HMGB1-2000 ng/ml組 185.374±7.127** 359.612±8.696** 71.981±6.781** 256.832±8.024**F值 608.611 1110.253 393.111 1284.402 P值 0.000 0.000 0.000 0.000

3 討論

HMGB1是一種普遍存在的核蛋白，在既往研 究 中，脂多 糖（lipopolysaccharide，LPS）、白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）等促炎因子需與HMGB1結(jié)合才能發(fā)揮完全毒性，如HMGB1+LPS可增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)而參與調(diào)控急性肺損傷的過程[9]；HMGB1+IL-1β復(fù)合物通過活化Toll樣受體信號促進(jìn)人椎間盤細(xì)胞炎性細(xì)胞因子的釋放[10]。本研究中，HMGB1的高濃度刺激可以增加16-HBE中 IL-8、TSLP、MMP-9、VEGF的釋放，這也說明了HMGB1在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中仍可能具有一定的促炎作用。而上述炎癥因子在哮喘的氣道炎癥中可誘導(dǎo)不同的生物學(xué)效應(yīng)。因此，推測HMGB1可能通過對16-HBE的炎癥調(diào)控來參與哮喘的發(fā)病。

以往的研究表明，RAGE和Toll樣受體是HMGB1信號通路中的主要受體HMGB1+LPS、HMGB1+IL-1β復(fù)合物皆可通過活化上述受體發(fā)揮強(qiáng)大的促炎能力[11]。本研究提示HMGB1-RAGE信號表達(dá)的增加可激活16-HBE的炎癥反應(yīng)，因RAGE在肺組織中高表達(dá)，所以高濃度的HMGB1可能首先影響RAGE信號的表達(dá)。通過蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)的顯影猜測，16-HBE表達(dá)Toll樣受體蛋白濃度較RAGE低，而HMGB1可能因有限的促炎作用而難以直接影響Toll樣受體的表達(dá)。HMGB1-RAGE信號的表達(dá)在哮喘發(fā)病中有重要意義：HMGB1、RAGE水平被證實(shí)與哮喘的嚴(yán)重性呈正相關(guān)[12]。而已有相關(guān)研究證實(shí)RAGE基因的單核苷酸多態(tài)性與哮喘發(fā)病率增加有關(guān)[13]。實(shí)際上，HMGB1的效應(yīng)細(xì)胞多種多樣，不同細(xì)胞表達(dá)受體種類和數(shù)目也不盡相同，實(shí)驗(yàn)樣本來源的多樣性可能導(dǎo)致HMGB1-RAGE或HMGB1-Toll樣受體信號表達(dá)情況的不同。如在哮喘小鼠模型中，HMGB1就可通過激活樹突狀細(xì)胞中的TLR2、TLR4、RAGE受體，間接促進(jìn)輔助2型T細(xì)胞、輔助型T細(xì)胞17分化，從而加劇該小鼠哮喘模型中氣道的炎癥反應(yīng)[14]。HMGB1及其信號通路在多種炎癥相關(guān)疾病中有重要地位，HMGB1靶向治療在許多實(shí)驗(yàn)室炎癥模型中已取得成功[15]，但尚未進(jìn)行HMGB1特異性藥物的臨床試驗(yàn)。本研究表明HMGB1及其相關(guān)信號的異常表達(dá)可能是哮喘的重要發(fā)病機(jī)制之一，阻斷該信號的異常表達(dá)將可能減輕哮喘的氣道炎癥反應(yīng)。而HMGB1參與調(diào)控哮喘的機(jī)制還有待進(jìn)一步研究，以更好地為治療哮喘提供新的理論支持。