人滋養層干細胞的分離培養與鑒定

陳娟 馬征來 盧永收 潘文霞 武傳葉 孫美英 李超

(1 青島大學附屬醫院產科，山東 青島 266003； 2 臨沂市婦幼保健院產科)

細胞滋養層細胞(CTB)來自于胚胎的滋養外胚層[1-2]，被稱為人滋養層干細胞(hTSCs),在胚胎植入早期可分化為兩種表型，一種是彼此融合形成的合體滋養細胞(ST)，參與胎盤的營養、代謝、內分泌等過程；另一種是絨毛外滋養層細胞(EVT)，位于胎盤絨毛的尖端處，具有從胎盤尖端向子宮間質和肌層血管遷移和侵襲性生長的能力[3]。滋養層細胞(TB)是胎盤功能的主要承擔者[4-5]，反復自然流產、早產、妊娠期高血壓、胎兒宮內生長受限等均與TB生物學功能異常有關[6-7]。由于人類胎盤的體內研究存在倫理學問題[8]，因此通過體外培養方法獲得足夠數量且可靠穩定的hTSCs成為TB生物學功能研究的關鍵[9-10]。目前已經成功構建了大鼠、小鼠、恒河猴等多種動物的胎盤模型[1，11]。1998年首次從小鼠的囊胚和胚外外胚層中分離出小鼠滋養層干細胞(mTSCs)[12]。2018年又從人類妊娠早期的絨毛組織中分離出具有分化為TB潛能的細胞株，命名為TSCT，接著通過該培養體系又從人類囊胚培養獲得與TSCT形態相似的細胞株，命名為TSblast，且TSblast的分子特征、轉錄水平以及分泌功能與妊娠早期胎盤的TB相似[13-14]。本研究在綜合分析先前培養方案的基礎上，對培養方法進行改進，以分離培養hTSCs，為TB相關生理和病理機制的研究提供體外模型?，F將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

收集臨沂市婦幼保健院生殖醫學科患者自愿捐贈常規體外受精-胚胎移植(IVF-ET)周期為5～6 d的新鮮正常囊胚8枚，置于玻璃化冷凍后液氮罐中長期保存。Y-27632購自美國Stemgent公司，山羊抗小鼠IgG(H&L)(Alexa Fluor?488)、山羊小鼠IgG(H&L)多克隆二抗(Alexa Fluor?555)購自英國Abcam公司，SB 431542購自英國Tocris公司，ITS-X supplement、A83-01、VPA購買于日本Wako公司，β-estradiol購于德國Sigma公司，Anti-HLA-G購自美國MBL公司。

1.2 方法

1.2.1hTSCs的培養與細胞核型分析 hTSCs培養基由DMEM/F12(體積分數0.94)、β-硫基乙醇(0.1 mmol/L)、胎牛血清(體積分數0.20)、青霉素鏈霉素雙抗(體積分數0.005)、牛血清白蛋白(體積分數0.03)、胰島素-轉鐵蛋白-硒培養基補充劑(體積分數0.01)、維生素C(1.5 mg/L)、表皮細胞生長因子(50 μg/L)、CHIR99021(2 μmol/L)、A83-01(0.5 μmol/L)、Y27632(5 μmol/L)、SB431542(1 μmol/L)及VPA(0.8 mmol/L)共同配制而成。①hTSCs培養：囊胚解凍后置于囊胚培養液中再培養2 h，去除透明帶，轉移至hTSCs培養基中，培養至第6天獲得第1代hTSCs，于體式鏡下用顯微切割針將貼壁生長組織切割成4～8塊，接種于4孔培養皿中；培養至第14天得到第2代hTSCs，以TryPLE消化成單細胞，接種于3.5 cm培養皿中繼續培養、傳代、凍存，供后續試驗使用。②細胞核型分析：選擇處于指數增殖期且生長旺盛的第7代hTSCs，以秋水仙素處理后，拍照觀察細胞核型。

1.2.2細胞免疫熒光技術檢測hTSCs中轉錄因子活化蛋白2C(TFAP2C)、細胞角蛋白7(CK7)以及轉錄因子GATA結合蛋白3(GATA-3)的表達 以40 g/L多聚甲醛固定第8代hTSCs 15 min，再用3 g/L Triton X-100孵育透膜1 h；以體積分數0.10的FBS+體積分數0.03的BSA室溫封閉0.5 h；然后分別加一抗(1∶200)、二抗(1∶1 000)，加入DAPI襯染細胞核后共聚焦顯微鏡觀察拍照，隨機選取100個hTSCs，計算熒光細胞數量，以百分比表示。

1.2.3實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測hTSCs中相關基因的表達 取第8、16代 hTSCs，分別采用 Trizol法提取總RNA，逆轉錄合成 cDNA，以此為模板進行RT-qPCR。根據試劑盒說明書配制反應體系，以U6作為內參照，每個樣品分別設置3個復孔，實驗重復進行3次。采用2-△△CT計算樣本中TFAP2C、CK7、GATA-3以及TEA轉錄因子4(TEAD4)基因的相對表達水平。引物名稱及其序列見表1。

表1 引物名稱及其序列

1.2.4Transwell實驗檢測hTSCs侵襲能力 將第9代hTSCs以每孔2.5×104個細胞接種于Trasnwell上室，下室為hTSCs培養基(未分化組)，同時再將第9代hTSCs以每孔2.5×104個細胞接種于Trasnwell上室，下室為分化培養基(分化組)，分別培養2、4、6 d。分化培養基的配制方法為：DMEM/F12(體積分數0.90)、β-硫基乙醇(0.1 mmol/L)、青霉素鏈霉素雙抗(體積分數0.005)、牛血清白蛋白(體積分數0.03)、胰島素-轉鐵蛋白-硒培養基補充劑(體積分數0.01)、A83-01(7.5 μmol/L)、Y27632(2.5 μmol/L)、NRG1(100 mg/L，第3天撤掉)、KOSR(體積分數0.04，第6天撤掉)。分別以免疫熒光法檢測兩組hTSCs培養至第2、4、6天時穿過transwell微孔的細胞數量，以及穿過transwell微孔的細胞中膠質細胞缺失因子1(GCM1)的表達情況，計算表達GCM1的細胞比例。實驗設6個復孔，每孔重復測量4次，結果取均值。

1.2.5hTSCs分化能力以及內分泌功能的檢測按照培養基不同將第9代hTSCs設置為分化組(hTSCs培養基)與未分化組(分化培養基)，分別采用RT-qPCR技術檢測兩組細胞中CK7、多配體蛋白聚糖-1(SDC-1)、人絨毛膜促性腺激素(β-hCG)和整合素α5(ITGA5)基因的相對表達水平。實驗設6個復孔，每孔重復測量4次，結果取均值。待兩組第9代hTSCs細胞密度約達80%時，將1×105個細胞分別接種于hTSCs培養基與分化培養基中繼續培養，使用全自動免疫檢驗系統檢測兩組培養第2～6天時培養基中雌二醇和孕酮的濃度。實驗設8個復孔，每孔重復測量4次，結果取均值。

1.3 統計學分析

2 結 果

2.1 hTSCs細胞核型分析

8枚正常囊胚成功培養出4株hTSCs。對第7代hTSCs進行核型分析，結果顯示為雌性(46，XX)3株，雄性(46，XY)1株，均具有正常細胞核型。

2.2 hTSCs中TFAP2C、CK7、GATA3檢測結果

免疫熒光技術檢測結果顯示，95%以上第8、16代hTSCs均表達TFAP2C、CK7和GATA3(圖1)。RT-qPCR檢測結果顯示，第8代hTSCs中CK7、GATA3、TFAP2C、TEAD4的相對表達量分別為0.41±0.11、0.15±0.03、0.16±0.08、0.03±0.11，第16代hTSCs中CK7、GATA3、TFAP2C、TEAD4的相對表達量分別為0.52±0.86、0.14±0.01、0.16±0.02、0.02±0.13，兩代間各基因表達量比較差異無顯著性(P>0.05)。

A：TFAP2C的表達情況，B：CK7的表達情況，C：GATA的表達情況，D：DAPI襯染細胞核，免疫熒光法，400倍

2.3 hTSCs侵襲能力檢測結果

析因設計方差分析結果顯示，時間、組別及時間組別的交互作用對穿過trasnswell微孔的細胞數量均存在有明顯影響(F組別=316.37，F時間=414.64，F交互=19.29，P<0.05)；單獨效應分析顯示，隨著培養時間的延長，兩組穿過trasnswell微孔的細胞數量差異有顯著性(F=255.81、178.12，P<0.05)；第2、4、6天兩組穿過trasnswell微孔的細胞數量比較差異具有顯著性(F=53.31～234.55、67.10，P<0.05)。析因設計方差分析表明，分組、時間及其交互作用對穿過trasnswell微孔的細胞表達GCM1的比例有顯著影響(F分組=114.58，F時間=338.80，F交互=33.40，P<0.05)；單獨效應分析顯示，隨著培養時間延長，兩組穿過trasnswell微孔的細胞表達GCM1的比例差異具有顯著性(F=288.92、83.28，P<0.05)，第4、6天兩組差異有顯著性(F=50.25、131.13，P<0.05)。見表2。

表2 分化組與未分化組hTSCs侵襲能力比較

2.4 hTSCs體外分化能力及內分泌功能檢測結果

RT-qPCR的檢測結果顯示，未分化組中CK7、SDC-1、β-hCG和ITGA5表達水平分別為9.2±2.3、7.1±1.4、34.4±3.2和27.2±1.9，分化組CK7、SDC-1、β-hCG和ITGA5表達水平分別為15.1±5.2、13.2±2.4、62.1±4.2和32.2±3.4。與未分化組相比較，分化組中各基因的表達水平均顯著升高(t=-6.78～-2.51，P<0.05)。析因設計方差分析結果顯示，分組、時間及其交互作用均對培養基中雌二醇的濃度具有顯著影響(F分組=387.87，F時間=33.68，F交互=17.56，P<0.05)；單獨效應分析顯示，隨著培養時間的延長兩組培養基中雌二醇的濃度差異有顯著性(F=42.03、9.21，P<0.05)，第2、4、6天兩組培養基中雌二醇的濃度比較差異均具有顯著性(F=43.68～210.18，P<0.05)。析因設計方差分析結果顯示，分組、時間及其交互作用均對培養基中孕酮的濃度有顯著影響(F分組=637.87，F時間=71.31，F交互=17.56，P<0.05))；單獨效應分析顯示，隨著培養時間的延長兩組培養基中孕酮的濃度比較差異有顯著性(F=87.66、125.32，P<0.05)，第2、4、6天分兩組培養基中孕酮的濃度比較差異均具有顯著性(F=25.06～225.62，P<0.05)。見表3。

表3 分化組與未分化組hTSCs內分泌功能檢測結果

3 討 論

TB在人類囊胚植入、胎盤形成以及妊娠維持過程中起到非常重要的作用,妊娠早期TB的異常分化會導致胎盤相關并發癥發生[15-16]。然而，受倫理和技術方面的限制，臨床中要想獲得足夠數量的早期妊娠原代TB非常困難。目前關于小鼠TB發育機制的研究取得了一定的進展，但人和小鼠的胎盤形成存在差異。因此，迫切需要一種可靠、穩定的可用于體外研究的人類TB[5,17]。

本研究中，使用8枚正常囊胚成功培養出4株hTSCs，對第7代hTSCs進行細胞核型分析，結果顯示為雌性(46，XX)3株，雄性(46，XY)1株，均具有正常核型。研究顯示，mTSCs的形成和腫瘤壞死因子-β(TGF-β)、成纖維生長因子(FGF)信號通路有關，而hTSCs的形成則和Wing-less/Integrated(Wnt)、表皮細胞生長因子(EGF)信號通路有關，因此無法直接套用小鼠的培養體系獲取hTSCs。本研究預實驗期間首先使用小鼠的mTSCs培養體系獲取hTSCs，細胞呈現克隆樣生長，表達TB標記物并且可以穩定傳代。當更換為hTSCs的培養體系后，hTSCs呈現纖維細胞樣上皮形態，仍然可以穩定表達TB標記物并且穩定傳代。此現象能夠表明hTSCs的細胞內既存在TGF-β、FGF信號通路，也存在WNT、EGF信號通路，具體的信號調節通路仍待進一步探究。

先前的研究顯示，TFAP2C、GATA3、CK7等為hTSCs特有標記物[18]。本研究免疫熒光顯示95%以上第8、16代hTSCs能夠表達TFAP2C、CK7以及GATA3；RT-qPCR技術檢測結果則顯示，CK7、GATA3、TFAP2C、TEAD4基因的相對表達量分別在兩代中無顯著性的差異。免疫熒光技術以及RT-qPCR技術檢測結果顯示，本研究培養獲得的細胞均表達以上標記物，并且隨著培養時間延長，表達穩定，因此可鑒定為hTSCs細胞。目前，許多細胞系，包括絨毛膜癌細胞系、永生化細胞系和BMP4處理的人胚胎干細胞(ESC)等，均已被用作TB細胞的模型。然而此類永生化細胞系(如HTR8/SVneo)和BMP4處理的人類ESC均不符合LEE等[19]于2016年提出的hTSCs標記物鑒定標準。一些絨毛膜癌細胞系雖然符合上述標準，但它們的轉錄組譜被認為與原代TB的轉錄組譜截然不同。而通過激活Wnt、EGF信號通路，并抑制TGF-β、組蛋白脫乙?；?、Rho相關蛋白激酶信號通路，可從人類妊娠早期的絨毛組織獲得具有分化為三種主要TB的細胞株，將其命名為TSCT細胞，與此同時通過該培養體系也可以從人類囊胚培養獲得與TSCT細胞相似的細胞株，將其命名為TSblast細胞，該細胞的分子特征、轉錄水平及分泌功能與妊娠早期胎盤滋養細胞相似[13-14]。但本團隊按照上述培養方法進行了預實驗，均無法培養獲得hTSCs，在綜合分析了以上研究的培養方案后，又根據我院實驗室前期的工作基礎對培養方法進行了改進和探索。

本研究Trasnswell結果顯示，隨著培養時間的延長，分化組第2、4、6天穿過trasnswell微孔的細胞數量均多于未分化組，表明與未分化組相比，分化組具有更強的侵襲能力。GCM1是一種胎盤特異性轉錄因子，在CTB、ST和EVT中均有表達[20-21],GCM1通過調節相關蛋白表達來介導TB融合和侵襲[22-23]。因此，GCM1對胎盤細胞分化和侵襲至關重要。本研究中，第2天分化組與未分化組中穿過trasnswell微孔的細胞表達GCM1比例無顯著統計學差異，第4、6天分化組均顯著高于未分化組，表明隨著培養時間延長，分化組hTSCs中的GCM1表達比例顯著高于未分化組，與體內胎盤發育規律相一致。

胎盤作為內分泌器官，將激素分泌到母體和胎兒循環中，從而影響妊娠結局[24]。ST是正常妊娠所需的關鍵激素，如人絨毛膜促性腺激素(hCG)和胎盤催乳素[25]、雌二醇、孕酮、神經遞質以及抑制素等[19]。hCG是一種由α亞單位和β亞單位組成的二聚體，由CGB基因編碼。hCG在刺激孕酮生成中起著關鍵作用，是反應妊娠發生的重要檢測指標，本研究所收集的培養基上清液中hCG濃度低于我院檢驗科儀器的最低檢測濃度，故本研究沒有對該指標進行檢測，對培養基中雌二醇和孕酮的濃度進行檢測，結果顯示分化組第2、4、6天培養基當中雌二醇、孕酮濃度均高于未分化組，符合胚胎著床時期激素分泌規律。

綜上所述，本研究培養獲得的hTSCs具有正常核型，免疫熒光技術以及RT-qPCR技術檢測結果顯示，hTSCs均表達hTSCs特有標記物，侵襲能力、分化能力、分泌功能等方面的檢測結果也顯示與體內TB相似，證明培養成功，所構建的培養體系適合hTSCs生長，這將為進一步研究人類TB的發育和功能提供有力的工具。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。

ConflictsofInterest：All authors disclose no relevant conflicts of interest.

倫理批準和知情同意：本研究涉及的所有試驗均已通過臨沂市婦幼保健院科學倫理委員會的審核批準(文件號：KYL-YXLL-2021014)。所有試驗過程均遵照《人體醫學研究的倫理準則》的條例進行。受試對象或其親屬已經簽署知情同意書。

EthicsApprovalandPatientConsent：All experimental protocols in this study were reviewed and approved by The Sicentific Ethics Committee of Linyi Maternal and Child Healthcare Hospital(Approval Letter No.KYL-YXLL-2021014), and all experimental protocols were carried out by following The Ethical Guidelines for Human Medical Research.Consent letters have been signed by the research participants or their relatives.

作者貢獻：陳娟、馬征來、盧永收、潘文霞、武傳葉、孫美英和李超均參與了研究設計以及論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發表該論文。

Contributions：CHENJuan,MAZhenglai,LUYongshou,PANWenxia,WUChuanye,SUNMeiying, andLIChaoall participated in the research design, as well as the writing and revision of the paper.All the authors have read the last version of the paper and consented submission.