PCSK9 在系統(tǒng)疾病和膿毒癥中的作用

陳祥梅 王濤

膿毒癥的是機體對感染的反應失調而導致危及生命的器官功能障礙，死亡率高達20%［1］，膿毒癥的根本發(fā)病機制尚未明了，涉及到復雜的全身炎癥網絡效應、基因多態(tài)性、免疫功能障礙、凝血功能異常、組織損傷以及宿主對不同感染病原微生物及其毒素的異常反應等多個方面。病原菌脂質(PL)入侵體內后會觸發(fā)炎癥反應，同時，機體不斷清除循環(huán)中的 PL 來減輕炎癥反應PL 觸發(fā)炎癥反應。血漿低密度脂蛋白(LDL)在PL 清除中期關鍵作用，PL 的體內清除機制既是機體從膿毒癥中恢復的最主要機制，又是當前膿毒癥研究的重要靶點［2］。前蛋白轉化酶(PCSK)家族的成員前蛋白轉化酶枯草溶菌素9(proprorein convertase subtilisinkexin type 9，PCSK9)具有靶向LDLR 進行降解的特殊功能［3，4］。臨床試驗表明PCSK9 能夠通過降低低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平有效和安全地預防心血管事件。PCSK9 蛋白主要在肝細胞中表達，在腸、腎、中樞神經系統(tǒng)也有低水平的表達。雖然PCSK9 通過調節(jié)肝臟LDLR 的表達來調節(jié)膽固醇代謝，但體外和體內的研究表明，PCSK9 還參與了其他多種生理過程。本文將PCSK9 在不同系統(tǒng)的病理生理作用以及對膿毒癥作用作了綜述。

1 PCSK9 的發(fā)現(xiàn)

2001年，PCSK9 首次在小腦神經元凋亡的研究中被發(fā)現(xiàn)，命名為神經細胞凋亡調節(jié)轉化酶1(NARC-1)［5］。PCSK9 基因位于1 號染色體p32 位點，編碼含692 個氨基酸的絲氨酸蛋白酶［6］。PCSK9 蛋白主要在肝細胞表達，在腸、腎、中樞神經系統(tǒng)也有低水平的表達。PCSK9 的轉錄主要由固醇調節(jié)元件結合蛋白-2(sterol regulatory element binding protein-2，SREBP-2)和肝細胞核因子1α(HNF1α)轉錄因子調節(jié)。

2 PCSK9 在各個系統(tǒng)中的作用

2.1 PCSK9 與心血管系統(tǒng) 有研究發(fā)現(xiàn)，PCSK 家族的成員可將未成熟的前蛋白如前激素、細胞因子和膜結合蛋白切割并轉化為它們的生物活性形式，從而維持體內平衡，PCSK9 最初被認為具有其他PCSK 家族成員相似的酶功能，但后來發(fā)現(xiàn)PCSK9 具有靶向LDLR 進行降解的特殊功能［7］。PCSK9 在LDL-C 代謝過程中扮演重要角色。LDL-C 和LDLR 結合后通過網格蛋白包被的囊泡內化進入肝細胞。LDL-C 則在溶酶體中被降解，而LDLR 重新循環(huán)回細胞膜上結合血液中游離的LDL-C。循環(huán)PCSK9 的催化結構域可以與肝細胞表面的LDLR 結合，細胞內的低pH 值環(huán)境增加了LDLR 降解。因而細胞表面LDLR 數量減少，LDL-C 不能被肝臟清除，血液中的LDL-C 水平升高與LDLR 親和力水平升高，以致LDLR 無法重新回到細胞表面，形成的復合物在溶酶體中均被降解［7］。

PCSK9 在家族性高膽固醇血癥(FH)的發(fā)病中扮演關鍵角色，該基因的功能獲得型患者會罹患高膽固醇 血癥［8］。PCSK9 是除LDL-R、載脂蛋白B(apolipoprotein B)外，第3 個與常染色體顯性FH 有關的基因［9］，當小鼠過表達PCSK9 時，總膽固醇及非高密度脂蛋白(non-high density lipoprotein cholesterol，non-HDL-C) 水平升高，LDLR 表達下降，證明了人類PCSK9 功能獲得性基因變異在高膽固醇血癥的發(fā)生發(fā)展中起了決定性作用。同時研究發(fā)現(xiàn)PCSK9 功能缺失型基因變異的人群表現(xiàn)為低膽固醇血癥，其心血管疾病的患病風險也大大降低。在一項關于PCSK9 在oxLDL 依賴性調節(jié)心肌細胞功能中的作用的實驗中，Wolf 等使用成年大鼠和小鼠心室心肌細胞和離體灌注心臟，通過酶聯(lián)免疫吸附劑測定(ELISA)、蛋白質印跡法(Western Blot)等實驗方法確定心肌細胞表達并釋放PCSK9，PCSK9 以自分泌方式作用于心肌細胞并損害其功能［10］。

2.2 PCSK9 與中樞神經系統(tǒng) PCSK9 在中樞神經系統(tǒng)表達，可能參與大腦發(fā)育和凋亡，載脂蛋白(ApoE)在阿爾茨海默病(AD)的病理生理學中起著關鍵作用。通過AD 患者腦脊液中PCSK9 水平升高的觀察，PCSK9可能通過降解負責星形膠質細胞來源的膽固醇攝取的神經元ApoE 受體來干擾中樞神經系統(tǒng)膽固醇轉運［11］，同時研究表明，在健康受試者中，血清PCSK9 濃度呈現(xiàn)明顯的日變化，在下午3 點左右濃度值最低，在其余時間里逐漸增加，并在傍晚/清晨左右達到峰值，與血清PCSK9 水平相比，腦脊液中PCSK9 的濃度在24 h 內保持不變［12］。然而，有研究表明，未發(fā)現(xiàn)兩種PCSK9多態(tài)性與散發(fā)性AD 的關聯(lián)［13］。鑒于凋亡在神經系統(tǒng)發(fā)育和退化中的重要作用，需要進一步的研究來了解PCSK9 是否、如何以及何時在老化和退化的大腦中上調，以及常見的PCSK9 多態(tài)性是否與神經元疾病相關。

2.3 PCSK9 與內分泌系統(tǒng) PCSK9 的合成除了受SREBP-2 和HNF1α 轉錄因子調節(jié)外，也受激素和營養(yǎng)狀況的影響。脂質和葡萄糖代謝之間的密切關系支持了PCSK9 可能參與葡萄糖穩(wěn)態(tài)的研究。膽固醇在決定細胞膜的物理化學特性和功能中起著至關重要的作用。適當的膜結構對于葡萄糖介導的胰島素分泌在胰腺β-cell 中是至關重要的，并且細胞膽固醇含量的改變可能導致β-cell 功能障礙［14］，下調PCSK9 可改善2 型糖尿病患者的脂質和葡萄糖代謝［15］。脂質代謝和卵巢疾病是多囊卵巢綜合征(polycystic ovarian syndrome，PCOS)的常見臨床表現(xiàn)，PCSK9 在血液、肝臟和卵巢中的異常高表達可能通過影響脂質代謝和卵巢功能而參與PCOS 病的發(fā)病機制，抑制PCSK9 可能部分逆轉PCOS 的病理改變。研究表明，PCSK9 有可能成為PCOS 診斷和治療的新的有吸引力的靶點［16］。

2.4 PCSK9 與消化系統(tǒng) 體外研究顯示，結腸癌細胞(Caco-2)可以分泌PCSK9，同時PCSK9 缺陷小鼠和Caco-2 實驗證實，PCSK9 可能直接調節(jié)富含甘油三酯顆粒的腸道分泌［17］，除了對餐后甘油三酯水平的影響外，PCSK9 還被認為可以調節(jié)經腸道膽固醇排泄(transintestinal cholesterol excretion，TICE)。在PCSK9 缺陷小鼠中，不改變每日食物攝入或腸道膽固醇吸收，TICE 增加，給予PCSK9 缺陷小鼠靜脈注射重組PCSK9則可迅速降低TICE［18］。

2.5 PCSK9 與腎臟系統(tǒng) 與其他系統(tǒng)一樣，PCSK9 可降低腎臟中LDLR 的表達，在小鼠腎病綜合征模型中，系統(tǒng)性或肝臟缺乏性PCSK9 可以預防血脂異常［19］，表明肝臟向血漿中分泌更多的PCSK9 可能會導致腎病綜合征相關血脂異常。體外研究表明，PCSK9 可能與阿米洛利敏感的上皮鈉通道亞單位-α(也稱為ENaC)相互作用，通過蛋白酶體途徑增加其降解［20］，此外，阿米洛利增加了PCSK9 缺陷小鼠和表達PCSK9 小鼠的尿鈉排泄，表明ENaC 活性不受PCSK9 的影響［21］，因此，雖然PCSK9 在腎臟中表達，并可能影響腎臟生理，但PCSK9 活性似乎對正常腎功能并不重要，并且抑制PCSK9 可能并不會給腎臟帶來不良反應［22］。

2.6 PCSK9 與風濕免疫系統(tǒng) Sánchez-Pérez 等［23］研究發(fā)現(xiàn)，系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者表現(xiàn)出脂質分布紊亂，大多數脂質相關分子下調，其中包括PCSK9 血清水平的下調，疾病的活動和損害與PCSK9 呈正相關。由于PCSK9 與心血管疾病有關，系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者心血管風險的增加可能會受到PCSK9 的影響，從而導致更大的損害和活動。然而，需要進一步的研究來評估PCSK9 是否在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者的血脂異常和動脈粥樣硬化加速中起關鍵作用。de Armas-Rillo 等通過酶聯(lián)免疫吸附試驗測定了160 例未接受過生物制劑治療的類風濕關節(jié)炎(RA)患者的PCSK9 水平，后患者開始抗腫瘤壞死因子-α(TNF-α)治療，并隨訪1年(疾病活動性由DAS28 確定)發(fā)現(xiàn)，在TNF -α 拮抗劑治療的RA 患者中，3、6、12 個月后，根據DAS28 測定的PCSK9 基線水平與疾病活動度呈負相關。同時該實驗還研究了PCSK9 對巨噬細胞和滑膜細胞的影響，其生理濃度范圍與循環(huán)中存在的PCSK9 相似。從而確定PCSK9 以濃度依賴的方式從巨噬細胞誘導TNF-α 和白細胞介素(IL)-β［24］。PCSK9 在預測RA 的預后中可能起作用，并且抑制PCSK9 可能在RA 的治療中有意義。同時研究表明，在中軸型脊柱關節(jié)炎患者，疾病活動度與PSCK9 呈顯著正相關，抗腫瘤壞死因子治療可降低PCSK9 血清水平［25］。

2.7 PCSK9 與癌癥 胃癌組織中PCSK9 的表達水平與癌癥進展和預后差相關，PCSK9 可以通過上調熱休克蛋白70(HSP70)激活 MAPK 信號通路，促進胃癌轉移和抑制凋亡。PCSK9 可能作為胃癌一種新的潛在治療靶點，同時，PCSK9 在胃癌中或許可以作為一種新的生物標志物［26］。在小鼠腫瘤模型中，基因缺失PCSK9或使用PCSK9 抗體可以增加腫瘤細胞表面主要組織相容性蛋白I 類(MHC I)蛋白的表達，促進細胞毒性T 細胞在腫瘤內的浸潤，促進MCH I 在溶酶體中的遷移和降解來破壞MHCI 在細胞表面的循環(huán)，減弱或阻止腫瘤在小鼠體內的生長［27］。

2.8 PCSK9 與傳染病 登革熱病毒(DENV)感染需要膽固醇作為一種親病毒因素，同時DENV 感染操縱膽固醇代謝需要低氧微環(huán)境(缺氧)，如肝臟、脾臟和淋巴結。因此他汀類藥物作為抗登革熱藥物缺乏療效。PCSK9 作為一種膽固醇代謝的關鍵調節(jié)劑，在缺氧細胞中表達增加［28］。

2.9 PCSK9 與免疫系統(tǒng) 研究表明，膽固醇代謝和免疫系統(tǒng)之間有直接聯(lián)系［29］，具有人源化免疫系統(tǒng)和腺相關病毒血清8 型(AAV8)介導的PCSK9 過表達的小鼠表現(xiàn)出高膽固醇血癥和T 細胞介導的肺部和肝臟炎癥反應。在這種高膽固醇血癥的情況下，T 細胞穩(wěn)態(tài)被破壞，CD4+和CD8+記憶T 細胞增加，循環(huán)中調節(jié)性T細胞減少［30］，因此評估PCSK9 抑制劑對免疫活性的調節(jié)是否對小鼠動脈粥樣硬化有影響是很有意義的。

2.10 PCSK9 與病毒感染 一些研究表明，PCSK9 與丙型肝炎病毒(HCV)感染之間存在聯(lián)系，PCSK9 可能會影響到HCV 通過LDLR 介導的方式侵入肝細胞［31］，PCSK9 可通過促進LDLR 的降解調節(jié)肝臟CD81 水平，CD81 是一種細胞表面蛋白，可促進HCV 進入肝細胞［32］。研究發(fā)現(xiàn)，抑制PCSK9 可通過有效降低膽固醇，阻斷嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2(SARS-CoV-2)進入宿主細胞或抑制其復制來抑制SARS-CoV-2 感染，但需要進一步的研究驗證及評估PCSK9 抑制劑這一類藥物在新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)潛在益處［33］。

3 PCSK9 在膿毒癥中的作用

膿毒癥是指由感染引起的全身炎癥反應綜合征，臨床證實有細菌存在或有高度可疑感染灶，故從本質上講膿毒癥是機體對感染性因素的反應。PL 通過Toll樣受體和其他可能受體共同參與炎癥反應，其中，PL是觸發(fā)炎癥反應中固有免疫受體的主要配體，主要包括革蘭陰性菌的脂多糖(LPS)、革蘭陽性菌中的脂壁酸(LPA)、真菌細胞壁中的磷脂甘露聚糖等［34］，它們或可成為觸發(fā)感染性炎癥反應的病原體相關分子模式(PAMPs)。宿主對病原體反應的啟動包括這些PAMPs與先天免疫受體的結合，先天免疫受體由整個宿主的免疫細胞、內皮細胞和薄壁細胞表達。包括Toll 樣受體(TLRs)在內的多種受體組成了一系列與多種PAMPs有親和力的先天免疫受體，可對許多不同的外源性“危險”信號(PAMPs)和內源性稱為損傷相關分子模式(DAMPs)的分子作出反應［35］。親脂性PAMPs(如LPS 和LTA)存在于脂蛋白(如LDL)中。因此，可以推測PCSK9 也可能影響病原體脂質清除。在PCSK9 敲除小鼠中，脂多糖誘導的活動、溫度、血壓和左心室射血分數等臨床指標水平均降低。PCSK9 清除小鼠血液中的內毒素清除率升高，多種炎癥因子(如TNF-a、IL-6、IL-10)減少［36］。在另一組實驗中，通過盲腸結扎和穿刺建立膿毒癥模型，6 h 后對動物進行液體復蘇和廣譜抗生素治療，然后給予PCSK9 抑制劑。實驗表明使用PCSK9 抑制劑治療的小鼠存活率增加，炎癥細胞因子反應減弱［37］。

在血液中，LPS和LTA均攜帶60%的高密度脂蛋白(HDL)及40%的LDL 和極低低密度脂蛋白(VLDL)［38］。轉運蛋白，如磷脂轉運蛋白(PLTP)和脂多糖結合蛋白(LBP)，允許這些病原體的脂質在脂蛋白之間快速轉運—主要是從HDL 轉運到LDL。由于LBP和PLTP 轉運病原體脂質，HDL 發(fā)生重構。這種重構被認為是膿毒癥期間觀察到的血脂異常的一個組成部分［39］。致病菌脂質結合轉運蛋白(如LBP)、殺菌通透性增加蛋白等與膽固醇轉運蛋白(如PLTP)、膽固醇酯轉運蛋白(CETP)等是同源的［40］。因此PL 轉運蛋白與膽固醇轉運蛋白在功能上存在明顯的交叉。例如LBP和PLTP 都可以有效地結合LPS。病原體脂質隨后被其所含的LDL 顆粒清除。在LDLR/LDL/LPS 內化后，LPS 在膽汁中代謝排泄。大多數病原體的脂清除是通過這種LDL/LDLR 相互作用，然而，其他途徑可能也發(fā)揮重要作用。HDL 中包含的病原體脂質也可能通過與HDL 相關的受體清除，如清道夫受體B1(SR-B1)。病原體脂質的一部分在VLDL 中攜帶。盡管極LDLR 主要存在于脂肪組織中，而LDLR 主要存在于肝臟中，但極低密度脂蛋白受體與LDLR 高度同源。因此，病原體脂質可能通過VLDL 受體從循環(huán)中清除［41］。一項測定脂肪細胞脂多糖攝取和極低密度脂蛋白受體蛋白表達的小鼠實驗表明，脂多糖可以通過極低密度脂蛋白受體在脂肪組織中隔離，這種隔離可能有助于改善膿毒癥的生存［42］。膿毒癥中PCSK9 水平升高可降低肝細胞表面的LDLR。這一機制可能是對膿毒癥患者低血漿LDL 濃度的調節(jié)反應，旨在通過細胞內SREBP 信號恢復LDL 濃度到更正常的水平。膿毒癥期間升高的PCSK9 降低了病原體脂質清除率，并可能將增加的病原體脂質轉移到TLR 上，從而導致炎癥反應增加［43］。同時如上文所述，心肌細胞表達并釋放PCSK9，PCSK9以自分泌方式作用于心肌細胞并損害其功能，膿毒癥時PCSK9 水平的升高是否會導致心肌損傷甚至膿毒癥心肌病的發(fā)生有待進一步研究。

4 小結

PCSK9 參與了各種生理和病理生理過程，主要通過LDLR 依賴機制，但也可通過LDLR 非依賴機制。在膿毒癥中，PCSK9 主要通過降低肝細胞表面的LDLR，降低PL 的清除，導致炎癥反應的增加，PCSK9 濃度的升高是否可以作為膿毒癥嚴重及預后程度的指標需待進一步驗證，同時在合并心血管基礎疾病的膿毒癥患者與普通膿毒癥患者中，PCSK9 水平是否存在差異，需要更多的研究。