不同等級高溫大曲微生物群落和代謝物的特征分析

丁 芳，張原頔，蔣英麗，陳 波，陳小雪，3 *，韓北忠

（1.中國農業大學 食品科學與營養工程學院 食品質量與安全北京實驗室，北京 100083；2.四川郎酒股份有限公司，四川 瀘州 510500；3.中國農業大學營養與健康系，北京 100083）

大曲作為白酒的糖化發酵劑，對白酒的質量有重要影響，其品質的穩定性受到白酒生產企業的高度重視[1]。大曲微生物主要包括霉菌、酵母菌、細菌和放線菌，這些微生物主要來自原料和生產環境，通過復雜的代謝活動分解原料，產生豐富的白酒風味前體物質和其他代謝物[2]。高溫大曲是以小麥為制曲原料，經過高溫培菌發酵，貯存三個月以上的糖化發酵劑，對醬香型白酒風味和品質的影響尤為重要[3]。在實際生產過程中，大曲質量評價和等級劃分很大程度上依賴于感官評價和簡單的理化指標檢測，感官評價指標主要包括外觀、斷面和香氣等，它具有方便和快速等特點[4-5]，理化指標主要包括水分、酸度、糖化力和液化力等。然而，由于感官評價的主觀性和局限性難以滿足大曲品質標準化生產的需求，因此根據感官全面探討不同等級高溫大曲微生物群落和代謝物組成的差異，有助于建立科學的大曲質量評價標準。

隨著現代分子生物學技術的發展，高通量測序技術（high-throughput sequencing，HTS）能夠深入解析高溫大曲的微生物群落結構。鄭亞倫等[6]采用高通量測序技術發現數字化高溫大曲和傳統高溫大曲在發酵過程中微生物群落結構具有顯著變化，發酵結束時，兩種高溫大曲的細菌群落均以克羅彭斯特菌屬（Kroppenstedtia）占絕對優勢，真菌群落以嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）和嗜熱真菌屬（Thermomyces）為優勢菌屬。楊少勇等[7]采用高通量測序技術發現高溫大曲真菌群落以嗜熱真菌屬（Thermomyces）和嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）為主，而中高溫大曲真菌群落以嗜熱真菌屬（Thermomyces）、嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）和曲霉菌屬（Aspergillus）為主。氣相色譜-離子遷移譜（gas chromatography-ion mobility spectroscopy，GC-IMS）結合了氣相色譜高分離度和離子遷移譜高靈敏度的優勢，無需任何特殊的樣品前處理，即可快速檢測大曲樣品中的揮發性代謝物[8]。ZHANG Y D等[9]通過GC-IMS檢測了新鮮大曲和成熟大曲中揮發性有機化合物組成，結果表明熟化前后高溫大曲中揮發性有機化合物存在顯著差異。此外，采用核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）對大曲樣品進行1H NMR代謝物譜分析發現，大曲樣品主要為非揮發性代謝物[10]。HU Y N等[11]通過核磁共振技術對三種清香型大曲進行了1H NMR代謝物譜分析，結果表明，乙醇、葡萄糖、脯氨酸、乳酸、阿拉伯糖醇、赤蘚糖醇、甘油、乙酸和甜菜堿是三種大曲中豐富的代謝物。

本研究通過比較不同等級高溫大曲微生物群落組成、揮發性和非揮發性代謝物組成及含量的差異，并結合理化指標檢測結果，綜合分析不同等級高溫大曲的品質特征，該研究一定程度上為高溫大曲質量評價標準體系的建立提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

高溫大曲樣品：高溫大曲熟化6個月，取自四川省某酒廠制曲車間，該批大曲的生產采用相同的原料和工藝；E.Z.N.A.soil 脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）Kit試劑盒：美國Omega公司；2-丁酮、2-戊酮、2-己酮、2-庚酮、2-辛酮和2-壬酮（均為分析純）：國藥集團化學試劑（北京）有限公司；斐林試劑（分析純）：上海源葉生物科技有限公司；福林酚（分析純）：北京索萊寶科技有限公司；碘化鉀（分析純）：上海麥克林生化科技有限公司；三氯乙酸（分析純）：合肥天健化工有限公司。

1.2 儀器與設備

1.3 方法

1.3.1 高溫大曲樣品的感官評價及采集

感官評價小組由10名經驗豐富的專業感官評判師組成，對熟化6個月的大曲從外觀、香氣和斷面等方面進行感官評價[5]。從不同等級大曲樣品中隨機抽取各6塊，粉碎混合好后置于無菌袋中，密封，樣品保存在-80 ℃，備用。

1.3.2 高溫大曲的理化指標檢測

水分、酸度、pH、糖化力和液化力測定：參考唐佳代等[12]的方法。中性蛋白酶活力的測定：參考ZHANG Y D等[9]的實驗方法。中性蛋白酶活力單位的定義：在溫度為40 ℃，pH7.0條件下，每分鐘從酪蛋白中水解產生1 μg酪氨酸所需的酶量為一個酶活力單位。

1.3.3 高溫大曲的DNA提取、PCR擴增及高通量測序

1.3.4 高溫大曲的揮發性化合物檢測

采用GC-IMS對高溫大曲的揮發性有機化合物進行分析。稱取1.000 g大曲粉末，置于20 mL頂空玻璃采樣瓶中，于60 ℃孵育15 min后進樣100 μL。

自動頂空進樣器條件：頂空孵育溫度為60 ℃；孵育時間為15 min；不分流進樣；頂空進樣體積為100 μL；進樣針溫度為85 ℃；加熱方式為振動加熱；振動速度為500 r/min。

氣相色譜條件：色譜柱為WAX毛細管柱（30m×0.53mm，1 μm）；柱溫為60 ℃；載氣為高純氮氣（N2）；載氣流速為初始流速2 mL/min保持2 min、2～10 min線性增加至10 mL/min、10～20 min 線 性增加至100 mL/min，20～30 min 保持100 mL/min。

離子遷移譜條件：遷移管長度為9.8 mm；管內線性電壓為500 V/cm；遷移管溫度為45 ℃；漂移氣為N2；放射源為β射線（氚，3H）；電離模式為正離子。

定性定量分析：通過對比標準信息庫美國國家標準技術研究所（national institute of standards and technology，NIST）和IMS數據庫對揮發性化合物進行定性分析并根據峰強度進行揮發性化合物定量。

1.3.5 高溫大曲非揮發性化合物檢測

高溫大曲非揮發性化合物檢測采用Avance III600-MHz NMR光譜儀進行測定。準確稱取0.300 g大曲粉末于2 mL離心管中，加入1.5 mL冷卻的超純水，研磨60 s，放在冰上冷卻10 min后，以13 000 r/min的轉速在4 ℃下離心10 min。取上清液1.0 mL于新的離心管中，加入1.0 mL重水磷酸鹽緩沖液，繼續以13 000 r/min的轉速在4 ℃下離心10 min，取適量上清液于5 mm內徑的核磁管中待測。1H NMR檢測條件和數據分析參考HU Y N等[11]的方法。

1.3.6 數據統計分析

采用QIIME2和R v3.2.0進行微生物組生物信息學分析，測序結果基于DADA2算法得到的擴增子序列變異體（amplicon sequence variants，ASV）進行劃分，分析其微生物群落多樣性及組成。利用SIMCA 14.1對代謝物數據進行主成分分析（principal component analysis，PCA）和偏最小二乘法-判別分析（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA）。使用IBM SPSS Statistics 26.0進行單因素方差分析（analysis of variance，ANOVA）和Duncan檢驗計算樣品間的顯著性（P＜0.05）。圖表的整理和繪制采用TBtools軟件。

2 結果與分析

2.1 高溫大曲樣品的感官評價

根據感官評價結果將高溫大曲樣品分為一級大曲（OJ）、優級大曲（YJ）和特級大曲（TJ），其感官特征見表1。

表1 不同等級高溫大曲的感官特征Table 1 Sensory characteristics of high-temperature Daqu with different grades

2.2 高溫大曲的理化特性分析

大曲的質量與其理化特性密切相關[13]。高溫大曲OJ、YJ和TJ的理化指標見圖1。由圖1A可知，水分含量由高到低的大曲分別為OJ、YJ、TJ，其中OJ的水分含量（13.2%）顯著高于大曲YJ和TJ（P＜0.05）。白酒釀造所用成熟大曲的水分含量一般不宜超過13%[14]。水分含量過高會導致大曲再次生霉，不利于大曲的質量。由圖1B可知，大曲OJ的pH值（6.45）顯著高于大曲YJ和TJ（P＜0.05）。由圖1C可知，大曲OJ的酸度（0.85 mmol/10 g）顯著低于大曲YJ和TJ（P＜0.05）。適當的酸度可一定程度上抑制雜菌生長，還可為有益微生物提供適宜的生存條件。大曲的酸度主要與產酸微生物的有機酸代謝及淀粉、蛋白質和脂肪等的降解有關[13]，而醬香型大曲的酸度范圍為（1.0～3.5）mmol/10 g[14]。

圖1 不同等級高溫大曲的理化特性比較Fig.1 Comparison of physicochemical properties of high-temperature Daqu with different grades

大曲中有豐富的淀粉酶、蛋白酶和纖維素酶等水解酶，復雜的水解酶是淀粉和蛋白質等大分子物質降解的驅動力，為微生物的代謝提供物質基礎[15]。由圖1D可知，大曲OJ的糖化力（289 mg/（g·h））高于YJ和TJ，且與TJ差異顯著（P＜0.05）。由圖1E可知，大曲OJ的液化力（1.6 g/（g·h））顯著高于YJ和TJ。由圖1F可知，大曲OJ的蛋白酶活力最低，與YJ和TJ均存在顯著差異（P＜0.05）。這些水解酶活性的不同，與三種高溫大曲不同的微生物群落組成有著直接的關聯性[16]。

2.3 高溫大曲的α-多樣性分析結果

Shannon指數代表微生物群落多樣性，Chao1指數常用來估計微生物群落豐富度，Good's coverage指數接近1.00表明測序深度足以代表所研究的微生物群落[17]。3個高溫大曲細菌和真菌群落的α-多樣性指數見表2。由表2可知，對于Shannon指數、Chao1指數和Good's coverage指數。所有高溫大曲樣品的細菌群落多樣性和豐富度均高于真菌群落，這與之前的研究一致[18]。與高溫大曲OJ和YJ相比，TJ的細菌表現出更高的微生物群落豐富度和多樣性，其細菌Shannon指數、Chao1指數和Good's coverage指數分別為5.366 13、66、0.999 9，真菌的Shannon指數、Chao1指數和Good's coverage指數分別為2.250 15、35、0.999 9。

表2 不同等級高溫大曲微生物群落的α-多樣性指數比較Table 2 Comparison of alpha diversity indexes of high-temperature Daqu with different grades

2.4 高溫大曲中微生物群落組成特征的比較

不同等級高溫大曲在擴增子序列變異體（ASV）水平上的細菌和真菌群落比較見圖2。

圖2 不同等級高溫大曲在擴增子序列變異體水平上的細菌和真菌群落比較Fig.2 Comparison of bacterial and fungal community of high-temperature Daqu with different grades at amplicon sequence variants level

由圖2a可知，3個等級高溫大曲共檢測到121個細菌ASV，其中大曲OJ、YJ和TJ的細菌ASV分別有46、66和66個，三者共有21個細菌ASV，分別屬于3個門和4個屬。由圖2b可知，3個等級高溫大曲共檢測到48個真菌ASV，ASV數量以大曲TJ最多（35個），大曲YJ次之（12個），大曲OJ最少（10個），三者共有4個ASV，分別屬于1個門和三個屬。這與α-多樣性指數的結果一致（表2）。進一步將3個等級高溫大曲中共有細菌和真菌ASV豐度歸一化后進行比較，由圖2c和圖2d可知，慢生芽孢桿菌屬（Lentibacillus）和嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）在大曲OJ中占優勢，踝節菌屬（Ralstonia）和糖多孢菌屬（Saccharopolyspora）在大曲YJ中占優勢，而克羅彭斯特菌屬（Kroppenstedtia）和曲霉菌屬（Aspergillus）在大曲TJ中更占優勢。

不同等級高溫大曲在屬水平上細菌和真菌群落相對豐度的比較見圖3。所有樣品在細菌屬水平上共24個物種，由圖3a可知，慢生芽孢桿菌屬（Lentibacillus）和克羅彭斯特菌屬（Kroppenstedtia）在3個等級高溫大曲中的相對豐度均＞20%，這也與其他學者對高溫大曲微生物群落的研究一致[19]。其中大曲OJ以慢生芽孢桿菌屬（Lentibacillus）（44.61%）、克羅彭斯特菌屬（Kroppenstedtia）（28.24%）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）（24.16%）和枝芽孢桿菌屬（Virgibacillus）（1.56%）為主。與大曲OJ相比，大曲YJ中克羅彭斯特菌屬（Kroppenstedtia）（24.57%）、慢生芽孢桿菌屬（Lentibacillus）（22.27%）和葡萄球菌屬（Staphylococcus）（0.75%）的相對豐度下降，而芽孢桿菌屬（Bacillus）（41.74%）和糖多孢菌屬（Saccharopolyspora）（1.23%）的相對豐度增加。大曲TJ中高相對豐度細菌屬組成如芽孢桿菌屬（Bacillus）（44.89%）、克羅彭斯特菌屬（Kroppenstedtia）（28.86%）、慢生芽孢桿菌屬（Lentibacillus）（24.49%）與大曲YJ的微生物群落結構更為相似。

圖3 不同等級高溫大曲在屬水平上細菌（a）和真菌群落（b）相對豐度的比較Fig.3 Comparison of relative abundance of bacterial (a) and fungal community (b) at genus level in high-temperature Daqu with different grades

克羅彭斯特菌屬（Kroppenstedtia）是高溫放線菌科的主要屬，能在大曲高溫高濕的環境下生長旺盛，適當的高溫和濕度有助于大曲中適度的美拉德反應，影響著大曲的質量。許多研究發現，該屬在各種大曲微生物群落中占優勢，但其在大曲生產中的作用尚不明確，需要進一步研究[8]。慢生芽孢桿菌屬（Lentibacillus）是醬香型白酒生產中重要的微生物菌群[19]。宏蛋白質組學數據表明，該屬能分泌多種蛋白酶，是具有強氨基酸代謝功能的優勢降解菌[20]。芽孢桿菌屬（Bacillus）是成熟大曲中常見的一種耐熱微生物，可分泌蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶等多種水解酶，是大曲重要的功能微生物[17，21-22]。此外，芽孢桿菌菌種的強化接種不僅能改變微生物群落結構，調節其代謝活動，還能改善大曲的風味特征[23]。葡萄球菌屬（Staphylococcus）可能從環境帶入到大曲生產中[2]。HU Y N等[11]比較了三種清香型大曲的微生物群落和代謝物特征，研究發現芽孢桿菌屬（Bacillus）和葡萄球菌屬（Staphylococcus）呈現顯著負相關。

由圖3b可知，曲霉屬（Aspergillus）在大曲OJ和TJ中占主導地位（相對豐度分別為66.67%和70.74%），曲霉是大曲中常見的優勢霉菌，能夠產生白酒固態釀造所需的多種酶[19]，而在大曲YJ中的相對豐度較低（16.60%）。大曲OJ中嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）的相對豐度（21.46%）遠高于YJ和TJ（相對豐度分別為8.96%和1.38%）。踝節菌屬（Rasamsonia）僅在大曲YJ中占絕對優勢（43.42%），該屬在纖維素降解和發酵中起著重要作用[24]。此外，絲衣霉屬（Byssochlamys）在大曲TJ中（1.04%）相對豐度更高。在DENG L等[3]的研究中，絲衣霉屬為黃色高溫大曲的優勢屬，能夠降解原料中的淀粉和纖維素。曲霉屬（Aspergillus）可產生廣泛的胞外酶，用于淀粉糖化、蛋白質水解等，在發酵過程中形成各種風味化合物[24-26]。嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）能產生大量耐熱酶，有效地降解碳水化合物[21]。糖化力和液化力是評價大曲品質的重要指標[27]。醬香型大曲的糖化力較清香型和濃香型大曲低，出倉曲糖化力一般在300 mg/（g·h）以下[28]。與大曲YJ和TJ相比，大曲OJ中較高的糖化力和液化力可能與樣品中曲霉屬和嗜熱子囊菌屬的較高相對豐度有關。結果表明，3個等級高溫大曲中優勢微生物種類和相對豐度均存在一定差異。由于大曲中微生物相互作用和酶系的復雜性，會產生不同的代謝產物，因此大曲OJ、YJ和TJ的代謝產物特征有待進一步研究。

2.5 高溫大曲中揮發性代謝物的比較

通過HS-GC-IMS測定了不同等級高溫大曲中揮發性化合物組成及含量，其結果見圖4。由圖4a可知，多個信號識別為一個化合物，是由于這些化合物通過漂移區時在離子和中性分子之間形成二聚體，包括乙酸、乙酸乙酯、1-丙醇、丁醛、2-甲基丁醛、丁醇、2-丁酮、3-甲基-1-丁醇、2-甲基丙醇、丙醛、乙醇、3-甲基-丁醛。指紋圖譜中每一行代表一個樣品中選取的全部信號峰，每一列代表同一個揮發性化合物在所有樣品中的信號峰。由圖4b可知，3種高溫大曲的揮發性代謝物種類和濃度存在明顯差異。圖中區域A物質（2-甲基丙醇單體、2-甲基丙醇二聚體、3-甲基-1-丁醇單體、3-甲基-1-丁醇二聚體、2-丁酮單體、2-丁酮二聚體、丁醇單體和丁醇二聚體等醇類物質）在大曲OJ樣品中的含量較高。區域B物質（2-甲基丁醛單體、2-甲基丁醛二聚體、丁醛單體、丁醛二聚體、1-丙醇單體、1-丙醇二聚體和2,3丁二酮）的含量在大曲YJ和TJ樣品中分布相似。因此，大曲OJ中醇類物質的含量較高，而大曲YJ和TJ中醛酮類物質的含量更高。區域C的物質（乙酸單體、乙酸二聚體、乙酸乙酯單體和乙酸乙酯二聚體）僅在大曲TJ中更為豐富。大曲風味化合物的形成是多種代謝反應的結果，在很大程度上受到復雜微生物群落的影響。

基于GC-IMS數據進行了PCA，結果見圖4c。由圖4c可知，大曲OJ、YJ和TJ組間樣本分離明顯，這表明不同等級高溫大曲中揮發性化合物組成和含量存在顯著差異。前兩個主成分解釋了總方差的84.6%，PC1和PC2的值分別為71.4%和13.2%。相比之下，大曲YJ和TJ中的揮發性化合物組成較為相似，兩者的差異主要體現在大曲TJ中乙酸和乙酸乙酯的含量更高。

圖4 不同等級高溫大曲中揮發性化合物比較Fig.4 Comparison of volatile compounds in high-temperature Daqu with different grades

2-甲基丙醇、3-甲基-1-丁醇和1-丙醇等醇類物質均為大曲和白酒中公認的風味成分，有著甜香、焦香和酒香等風味特征[29-30]。丙醛和丁醛等醛類的氣味閾值低，有助于形成發酵食品的獨特風味。酯類通常提供著怡人的果香、花香和甜香等氣味，已被證明是白酒中十分重要的成分，也可能是影響大曲香氣的重要因素[13]。

2.6 高溫大曲中非揮發性代謝物的比較

采用氫譜核磁共振技術對大曲樣品進行了1H NMR代謝物譜分析，大曲OJ、YJ和TJ中共檢出280種非揮發性代謝物，包括糖類、醇類、酸類、多元醇類、氨基酸及其衍生物等。這些代謝物主要是由美拉德反應、酶促反應和微生物代謝等一系列復雜過程產生的[9]。

不同等級高溫大曲中非揮發性代謝物分析結果見圖5。由圖5a可知，通過建立PLS-DA模型對3種高溫大曲樣品的非揮發性代謝物進行差異分析，結果中R2X（39.6%）和R2Y（21.7%）解釋了61.3%的總方差貢獻率，其中R2X和R2Y分別表示模型對X和Y的解釋度。可以看到3種高溫大曲的非揮發性代謝物種類和濃度存在顯著差異。

由圖5b可知，不同等級高溫大曲中重要的差異代謝物共58種（變量重要性投影（variable importance in projection，VIP）＞1）。大曲OJ中的乙醇、木糖醇和乳酸鹽含量高于YJ和TJ，大曲YJ中的葡萄糖、果糖、甜菜堿、2-氨基己二酸、醋酸鹽、葡萄糖醇、赤蘚糖醇和阿拉伯糖醇的含量高于大曲OJ和TJ。石亞林等[31]的研究表明，大曲中的游離態糖和糖醇主要是葡萄糖、甘露醇和核糖醇。大曲TJ中非揮發性代謝物的種類更為豐富、含量更高，尤其是多種氨基酸（包括絲氨酸、精氨酸、鳥氨酸、胱氨酸、脯氨酸、纈氨酸、谷氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、高絲氨酸和丙氨酸）含量高于大曲OJ和YJ。大曲生產過程中，蛋白質被蛋白酶水解為多肽和氨基酸，這與白酒風味物質的形成有密切的聯系[15]。曲霉屬和芽孢桿菌屬是產生淀粉酶和蛋白酶的重要功能微生物[29，32]，大曲TJ中蛋白酶活力和氨基酸含量更高與這2個菌屬的代謝活動密切相關。大部分非揮發性代謝物含量在大曲TJ中更高，反映出大曲TJ中的各種代謝活動更為旺盛。葡萄糖、甘露醇、赤蘚糖醇、谷氨酸、甘露糖、2-磷酸甘油酸酯、脯氨酸等是3個等級高溫大曲中豐富的代謝物，這些代謝物大多被認為是大曲中主要的風味物質及其前體物質[33]。

圖5 不同等級高溫大曲中非揮發性化合物的偏最小二乘法-判別分析（a）及層次聚類分析熱圖（b）Fig.5 Partial least squares-discriminant analysis (a) and hierarchical cluster analysis heatmap (b) of non-volatile compounds in high-temperature Daqu with different grades

3 結論

本研究對不同等級高溫大曲微生物群落和代謝物的潛在差異進行了比較。微生物測序結果表明，芽孢桿菌屬、葡萄球菌屬和踝節菌屬等是造成大曲OJ、YJ和TJ微生物群落組成差異的重要菌屬。揮發性代謝物檢測結果表明，3個等級高溫大曲的揮發性代謝物組成及含量存在顯著差異，體現在醇類、醛酮類和酯類等物質。非揮發性代謝物檢測結果表明，3個等級高溫大曲中非揮發性代謝物譜存在顯著差異，主要體現在氨基酸等物質；此外大曲TJ中的非揮發性代謝物種類更加豐富，含量更高。后續研究應側重于對不同等級高溫大曲中微生物的功能進行研究，以更好地了解微生物群落在大曲中的作用。