陳釀方式對赤水曬醋醋醅的影響研究

袁治浩，盧紅梅 *，李榮源，陳 莉，徐融融

（1.貴州大學 釀酒與食品工程學院，貴州 貴陽 550025；2.貴州大學 貴州省發酵工程與生物制藥重點實驗室，貴州 貴陽 550025）

食醋作為調味品在我國已有悠久的歷史，傳統的固態發酵技術使釀造的食醋富含營養成分，具有獨特的藥理保健功效[1]。赤水曬醋是貴州省赤水市生產的一種帶有地方性特色的優質食醋產品，其主要特點是以麥麩、大米為主要原料，輔以100多種中草藥配方制成的藥曲，經蒸煮、發酵、日曬制成，成品醋酸味醇厚，微甜爽口，回味悠長，深受人們歡迎。

赤水曬醋采用傳統的麩醋生產工藝，其醋醅曝曬階段是一個自然的陳釀過程，整個生產周期達兩年之久，且對季節氣候依賴性較強[2]。在這一過程中，陳釀醋醅在品質風味上有較大提升，主要有兩方面的原因，一是醋酸發酵結束后的微生物的長期作用，促進曬醋中風味物質的積累[3]；二是經曝曬產生的熱作用，致使醋醅中的成分含量發生了變化，使口味更加濃厚[4]。吳震等[5]監測赤水曬醋生產過程中指標的變化，探究其品質的形成因素及發酵工藝特點；楊新等[6]研究解決了赤水曬醋中雜菌污染的問題，并提出了最佳的滅菌方案；楊沙等[7]建立了一種采用高效液相色譜法同時檢測赤水曬醋中6種功能性成分的方法，以此對曬醋的質量進行分析和評價。但是，關于不同陳釀方式對赤水曬醋醋醅的影響鮮見報道，因此，該研究探究了赤水曬醋醋醅在不同陳釀方式下對其品質的影響，對比醋醅經不同陳釀方式陳釀一年后在理化指標和功能性含量上的差異及變化，為赤水曬醋的傳統釀造工藝的改進及品質改良提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

醋醅樣品：貴州省赤水某曬醋企業；3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）、三氯乙酸：國藥集團化學試劑有限公司；氫氧化鈉、酒石酸鉀鈉、葡萄糖、甲醛、氯化鈉、鐵氰化鉀：成都金山化學試劑有限公司；苯酚、硫酸亞鐵：天津市永大化學試劑有限公司；亞硫酸鈉、沒食子酸、硝酸鋁：天京市科密歐化學試劑有限公司；蘆丁（色譜純）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基、2,2'-聯氮-雙-3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2'-azino-bis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid），ABTS）自由基：北京索萊寶科技有限公司；所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

DZ-1電位滴定儀：上海大普儀器有限公司；722S可見分光光度計：上海菁華科技儀器有限公司；HH-2 數顯恒溫水浴鍋：常州奧華儀器有限公司；FA2004N電子分析天平：上海菁海儀器有限公司；SPX生化培養箱：上海博訊實業有限公司。

1.3 方法

1.3.1 陳釀方式

將醋酸發酵結束后的醋醅裝入陶壇內，設置曝曬陳釀壇、常溫陳釀壇（置于陰涼處）、25 ℃控溫陳釀壇、37 ℃控溫陳釀壇，每組設置三個平行。

曝曬陳釀壇放置在無遮擋物的平臺上，模擬生產實際中曝曬陳釀；常溫陳釀壇放置在無陽光照射的陰涼處；控溫陳釀壇放置在對應溫度的生化培養箱內，并用溫度計檢測壇內溫度。

1.3.2 待測樣品取樣

曝曬/常溫醋醅上層樣品：移去表面食鹽，采用取樣器取離表面約1/3處的醋醅200 g至取樣袋中，混勻備用；

曝曬/常溫醋醅下層樣品：采用取樣器取離陳釀壇底部約1/3處的醋醅200 g至取樣袋中，混勻備用；

控溫陳釀壇樣品：根據曝曬/常溫醋醅的取樣方法，各取壇內上、下層等量的醋醅混勻，取混勻醋醅200 g至取樣袋中，混勻備用。

取樣編號為曝曬陳釀壇上層（MTS）、曝曬陳釀壇下層（MTX）、常溫陳釀壇上層（CMTS）、常溫陳釀壇下層（CMTX）、25 ℃控溫陳釀（25 CP）、37 ℃控溫陳釀（37 CP）。根據季節溫度的差異，設定采樣時間為當年1、4、6、8、10月以及次年1月，分別記為陳釀0、3、5、7、9、12個月，共6批次的樣品進行檢測分析。

1.3.3 樣品處理方法

依照赤水曬醋傳統的淋醋方法，結合課題組以往對赤水曬醋的研究，按醋醅∶水=1.0∶1.2的比例對醋醅樣品進行處理，即精確稱取50 g醋醅置于燒杯中，加入60 mL蒸餾水，保鮮膜封口，室溫靜置6 h，中速濾紙過濾，取濾液待測。

1.3.4 理化指標的測定

水分的測定：參照GB 5009.3—2016《食品安全國家標準食品中水分的測定》[8]；總酸的測定：參照GB12456—2021《食品安全國家標準食品中總酸的測定》[9]；還原糖的測定：DNS比色法[10]；氨基酸態氮的測定：參照GB 5009.235—2016《食品中氨基酸態氮的測定》中的酸度計法[11]；可溶性無鹽固形物的測定：參照GB 18186—2000《釀造醬油》[12]；總酚的測定：參照Folin-Ciocalteus法[13]；總黃酮的測定：硝酸鋁比色法[14]。

1.3.5 美拉德反應初級階段和中級階段反應程度測定

參照謝凡等[15-17]的方法加以改進，在波長294 nm、360 nm處測定樣品的吸光度值。

1.3.6 抗氧化能力的測定

DPPH自由基清除率的測定：參照安家靜[18]的方法稍作改進；ABTS+自由基清除率的測定：參照吳煜樟[19]的方法稍作改進；羥基自由基清除率的測定：參照侯曉梅等[20-21]的方法稍作改進。

2 結果與分析

2.1 不同陳釀方式對陳釀過程中水分含量的影響

赤水曬醋采用傳統的曝曬工藝，醋醅在曝曬過程中水分含量會隨時間而減少，水分的散失讓醋醅中的物質得到濃縮，使赤水曬醋的香氣更加濃厚，陳釀周期赤水曬醋中水分的含量變化見圖1。

圖1 不同陳釀方式對水分含量的影響Fig.1 Effect of different aging method on moisture

由圖1可知，醋酸發酵結束后剛轉入陳釀壇時醋醅的水分含量為55.46%，在轉移至發酵壇后醋醅中的水分含量隨著陳釀時間的延長而逐漸降低。37 ℃控溫陳釀樣品在陳釀12個月后水分含量為47.11%，25 ℃控溫陳釀樣品中的水分含量下降趨勢與曝曬陳釀上層醋醅的較為相似；曝曬陳釀上層與下層醋醅中水分差異明顯，可能原因是上層醋醅受到日照的時間更長，致使醋醅中的水分在陳釀過程中揮發，但對赤水曬醋的功能性以及風味會產生一定程度的影響。

2.2 不同陳釀方式對陳釀過程中總酸的影響

食醋中的總酸是酸性物質的總量，是發酵過程中檢驗發酵程度的一個重要理化指標，是影響食醋酸味的主要原因，陳釀周期總酸含量的變化見圖2。

圖2 不同陳釀方式對總酸含量的影響Fig.2 Effect of different aging method on total acid content

由圖2可知，不同陳釀方式的醋醅在為期一年的陳釀期內總酸含量持續增加，且控溫陳釀醋醅樣品中的總酸明顯高于曝曬陳釀醋醅和常溫陳釀醋醅。剛轉入曝曬陳釀壇時測得總酸含量為2.08 g/100 mL，37 ℃控溫陳釀樣品中的總酸在陳釀12個月后達到3.31 g/100 mL，25 ℃控溫陳釀次之，而常溫陳釀樣品的總酸含量僅為2.50 g/100 mL。赤水曬醋中總酸積累主要集中在醋酸發酵階段，曝曬陳釀醋醅階段中的總酸增長較小，控溫陳釀樣品的總酸相比于曝曬陳釀樣品在此階段有較大的增加，可能與水分的減少和陳釀溫度的升高有關；有研究表明，在山西老陳醋的熏醅研究中，總酸含量在熏蒸過程中會升高，GRIMBLEBY F H[22]研究認為，加熱能消除蛋白質的堿性基團，從而增加樣品中的可滴定酸，使樣品中的總酸含量增加。

2.3 不同陳釀方式對陳釀過程中還原糖的影響

陳釀周期還原糖含量的變化見圖3。

圖3 不同陳釀方式對還原糖含量的影響Fig.3 Effect of different aging method on reducing sugar content

由圖3可知，在陳釀周期內醋醅中還原糖含量整體呈現先減少后增加，然后趨于平緩的趨勢。剛轉入陳釀壇時所測得的還原糖含量為0.64 g/100 mL，陳釀周期結束時，37 ℃控溫陳釀樣品中的還原糖含量為0.68 g/100 mL，25 ℃控溫陳釀樣品的還原糖含量為0.41 g/100 mL，常溫陳釀壇上層樣品的還原糖含量為0.21 g/100 mL，常溫陳釀壇下層樣品的還原糖含量為0.15 g/100 mL。不同陳釀方式醋醅中的還原糖含量變化有明顯差異，還原糖含量在前5個月內迅速下降，而控溫陳釀醋醅在陳釀周期后期還原糖含量都有所提升，且37 ℃控溫陳釀樣品提升的效果最明顯，推測原因可能是該溫度有利于酶的分解，使得殘留淀粉得到進一步的利用。在秦興[23]的研究中，赤水曬醋醋醅曝曬陳釀1年后淀粉含量從48.00 g/100 g減少到40.00 g/100 g，說明在陳釀過程中淀粉質原料會因為微生物的生長而得到進一步的分解利用，導致醋醅中的還原糖含量增加。

2.4 不同陳釀方式對陳釀過程中氨基酸態氮的影響

氨基酸態氮是指以氨基酸形式存在的氮元素的含量，發酵食品中的氨基酸態氮主要來源于發酵原料中的蛋白質分解和發酵過程中發生的微生物細胞自溶[24]。陳釀周期氨基酸態氮含量的變化見圖4。

圖4 不同陳釀方式對氨基酸態氮含量的影響Fig.4 Effect of different aging method on amino acid content

由圖4可知，三種陳釀方式的醋醅在陳釀前3個月的氨基酸態氮含量都有較大幅度的增加，之后增加的趨勢放緩，其中25 ℃控溫陳釀樣品中的氨基酸態氮含量為0.27 g/100 mL，37 ℃控溫陳釀樣品為0.26 g/100 mL。還原糖和氨基酸都是美拉德反應的重要底物，溫度上升，還原糖和氨基酸被大量消耗，美拉德反應加劇，導致37 ℃控溫陳釀醋醅中氨基酸態氮低于25 ℃陳釀；另外可能與發酵原料中的蛋白質分解和發酵過程中產蛋白酶的微生物生長活躍有關[25]。第7個月和第9個月的數據異常可能和高溫時美拉德反應關聯，美拉德反應會消耗醋醅中的氨基酸，這可能是造成氨基酸態氮含量在此時間段內無明顯增加的原因。

2.5 不同陳釀方式對陳釀過程中可溶性無鹽固形物的影響

可溶性無鹽固形物是指食醋中除水、食鹽外的其他可溶性物質，主要包括蛋白質的分解產物、糖類的分解產物等，是影響食醋風味和品質的重要指標。陳釀周期可溶性無鹽固形物含量的變化見圖5。由圖5可知，醋醅中的可溶性無鹽固形物隨著陳釀時間的延長而增加，陳釀12個月后趨于平緩。醋酸發酵結束剛轉入曝曬陳釀壇時醋醅的可溶性無鹽固形物含量為6.63 g/100 mL，在陳釀周期結束時，37 ℃控溫陳釀和25 ℃控溫陳釀樣品中的可溶性無鹽固形物含量最高，分別為12.21 g/100 mL和9.95 g/100 mL，常溫陳釀壇上層樣品為8.48 g/100 mL，其余樣品中的含量較低。陳釀溫度會影響醋醅中的一些生化反應，如較高的溫度會促進酯化反應的反應程度，生成的一類物質使可溶性無鹽固形物含量增加，并且原料中麩皮本身含大量的α-淀粉酶、β-淀粉酶，會分解麩皮中的淀粉，導致可溶性無鹽固形物增加；隨著陳釀時間的延長，產酸菌大量繁殖、營養物質大量消耗使增長趨于平緩[26]。

圖5 不同陳釀方式對無鹽固形物含量的影響Fig.5 Effect of different aging method on salt-free solids content

2.6 不同陳釀方式對陳釀過程中總酚及總黃酮的影響

陳釀周期總酚及總黃酮含量的變化見圖6。由圖6可知，不同陳釀方式醋醅中總酚和總黃酮含量在陳釀過程中整體呈現上升的趨勢。由圖6A可知，醋酸發酵結束剛轉入陳釀壇時醋醅的總酚含量為0.15 g/100 mL，醋醅總酚含量受溫度影響較大，37 ℃控溫陳釀樣品中的總酚含量遠高于其他樣品，達到0.34 g/100 mL，25 ℃控溫陳釀樣品中的總酚含量為0.29 g/100 mL，常溫陳釀樣品的總酚含量最少；由圖6 B可知，37 ℃控溫陳釀樣品中總黃酮含量從最初的0.13 g/100 mL增加至0.33 g/100 mL，25 ℃控溫陳釀樣品中的總黃酮含量增加至0.24 g/100 mL，分別是原來的2.6倍和1.9倍。這表明醋醅陳釀過程中在一定溫度范圍內溫度對總酚、總黃酮含量的影響是呈正相關的，推測原因可能是溫度的升高，提高了醋醅中酶的活性，使原料中的酚類、黃酮類物質得到釋放，使得在醋醅中含量增加；也可能是控溫陳釀導致長時間的高熱環境，促進美拉德反應的進行生成還原性中間產物，并且由于長時間的較高溫度，醋醅中的水分會大量蒸發，使得這些物質得到了濃縮[27-28]。

圖6 不同陳釀方式對總酚（A）及總黃酮（B）含量的影響Fig.6 Effect of different aging method on total phenol (A) and total flavnoid (B) content

2.7 美拉德反應初級階段和中級階段反應程度的測定

美拉德反應一般可分為三個反應階段：初級階段、中級階段、最終階段。美拉德反應初級階段主要產生酮類及醛類等小分子化合物，這類化合物在波長294 nm處有特征吸收峰，因此波長294 nm的吸光度值可反映美拉德反應所生成的初級階段產物的量，其積累量能反映美拉德反應程度[14，29]；美拉德中級階段主要取決于反應體系的pH：pH≤7時，其主要經1,2-烯醇化反應最終生成羰基甲基呋喃或呋喃醛；pH＞7時，進行2,3-烯醇化反應，產生還原酮類及脫氫還原酮類；繼續裂解反應形成含羰基或二羰基化合物，在波長360 nm處有特征吸收峰[12]。

各陳釀方式醋醅樣品中美拉德反應初級階段及中級階段反應程度的變化見圖7。由圖7A可知，隨著陳釀時間的延長，醋醅中美拉德反應初級階段的反應程度受溫度的影響較小；分析原因可能是由于在反應初期，反應底物還原糖、氨基酸較充分，迅速產生大量的初級產物，隨著反應底物逐漸被消耗，初級產物生成速率開始變緩；隨著陳釀時間的延長，初級產物的大量生成，醋醅中的pH下降。由圖7 B可知，37 ℃控溫陳釀樣品的中級階段反應程度遠高于其他樣品，由于反應底物減少的原因，中級階段反應程度在陳釀9個月后上升速度有所下降；溫度越高，反應速率越快，達到相同吸光度值的時間越短，說明美拉德反應越劇烈。

圖7 不同陳釀方式對美拉德反應初級（A）及中級（B）階段反應程度的影響Fig.7 Effect of different aging method on the reaction degree in the primary (A) and middle (B) stage of Maillard reaction

2.8 不同陳釀方式對陳釀過程中DPPH·、ABTS+·和·OH清除能力的影響

由圖8可知，在一定濃度范圍內，曝曬陳釀醋醅、常溫陳釀醋醅和控溫陳釀醋醅均對DPPH·、ABTS+·和·OH有清除能力，且其清除能力與陳釀時間呈正相關。不同陳釀方式對3種自由基清除率都表現出37 ℃控溫陳釀＞25 ℃控溫陳釀＞曝曬陳釀壇上層，其中37 ℃控溫陳釀、25 ℃控溫陳釀、曝曬陳釀壇上層的DPPH自由基清除率分別為90.94%、89.83%、86.18%，ABTS 自由基清除率分別為86.40%、76.98%、68.52%，羥基自由基清除率分別為63.70%、56.80%、56.30%。結果表明，不同陳釀方式的醋醅均對DPPH·、ABTS+·和·OH有清除能力，且自由基清除率的變化規律隨陳釀時間的延長而增強，這與樣品中黃酮和總酚的變化規律一致。曝曬陳釀壇上層的3種自由基的清除能力均大于曝曬陳釀壇下層，原因可能是在曝曬陳釀過程中，表層醋醅受到陽光直曬以及熱氣上行的影響，造成表層醋醅的溫度高于下層醋醅，而在常溫陳釀醋醅中，上層醋醅與下層醋醅之間無明顯差異，表明醋醅的抗氧化能力與陳釀的溫度有密切聯系。溫度的升高，有利于美拉德反應的進行，而類黑精作為美拉德反應的一類終產物，有大量研究證實[30-34]，食品類黑精具有顯著的抗氧化活性。此前研究已經發現在37 ℃控溫陳釀過程中，醋醅樣品中美拉德反應較為活躍，將會生成大量的美拉德反應產物，從而增加樣品的抗氧化活性。

圖8 不同陳釀方式對DPPH·（A）、ABTS＋·（B）及·OH（C）清除率的影響Fig.8 Effect of different aging method on DPPH·(A),ABTS＋·(B) and·OH (C) scavenging rate

3 討論

赤水曬醋作為貴州名醋和當地的支柱產業，近年來，廣泛受到大眾的喜愛。但是由于赤水曬醋一致沿用傳統的生產工藝，曝曬陳釀階段耗時數年，再加上科研投入不足，導致難以科學解讀曝曬對曬醋獨特風格的作用以及曝曬時長對其品質的影響規律。本試驗通過對3種陳釀方式醋醅的理化指標、總酚、黃酮及自由基清除率進行測定，解析曝曬工藝對赤水曬醋品質的影響。結果發現，3種醋醅陳釀方式對赤水曬醋品質的影響有明顯差異，控溫陳釀優于曝曬陳釀和常溫陳釀，并且37 ℃控溫陳釀的表現優于25 ℃控溫陳釀；37 ℃控溫陳釀醋醅在陳釀周期結束時的總酸含量為3.31 g/100 mL，還原糖含量為0.68 g/100 mL，氨基酸態氮含量為0.26 g/100 mL，可溶性無鹽固形物含量為12.21 g/100 mL，總酚含量為0.34 g/100 mL，總黃酮含量為0.33 g/100 mL，自由基的清除率優于其他兩種陳釀方式，且3種醋醅陳釀方式的黃酮、總酚及自由基清除率都隨著陳釀周期的延長而增加，這與陳怡等[35]研究山西老陳醋在陳釀過程中總酚、總黃酮以及總抗氧化能力隨陳釀時間增加而增加的結論一致。試驗研究表明，醋醅在37 ℃控溫條件下更有利于醋醅發酵成熟，對赤水曬醋的品質增強有促進作用，且短期的醋醅控溫陳釀能達到更長時間曝曬陳釀的效果；從赤水曬醋的品質與產能出發，在一定程度上說明赤水曬醋的陳釀工藝有一定的改進空間，比如溫度的控制范圍需要進一步的探究以及更長時間的控溫陳釀對醋醅品質變化影響程度仍可進一步的探索，為曬醋陳釀最佳周期的研究或生產應用提供思路。

4 結論

研究結果表明，在陳釀周期內，37 ℃控溫陳釀優于25 ℃控溫陳釀和其他兩種陳釀方式，且3種醋醅陳釀方式對赤水曬醋陳釀階段品質的影響均有明顯差異。在赤水曬醋的理化特征及功能性上，短期的醋醅控溫陳釀能達到更長時間的曝曬陳釀效果，在一定程度為赤水曬醋的陳釀工藝及品質改良提供改進空間。