響應面法優化芝麻香型白酒酒醅中阿魏酸的提取工藝

趙巧珍，孟 武 *，劉玉濤，張夢夢，繆坤辰，王文潔，胥鑫鈺，李小杰，崔新瑩

（1.齊魯工業大學（山東省科學院）生物工程學院，山東 濟南 250353；2.濟南趵突泉釀酒有限責任公司，山東 濟南 250115）

阿魏酸（ferulic acid，FA），也稱為3-甲氧基-4-羥基肉桂酸，結構式C10H10O4，是肉桂酸（也稱為3-苯基-2-丙烯酸，桂皮酸）的衍生物之一，是一種酚酸，最初從香阿魏中分離得到[1-2]。阿魏酸因具有強抗氧化[3]和抗炎[4]功能，所以能對阿茲海默癥[5]、心腦血管[6]、癌癥[7-10]等疾病的預防和治療起一定的作用。近年來，在食品與飲料行業，將阿魏酸作為健康因子的研究越來越多[11-14]。國內外對于阿魏酸的提取分離方法主要包括滲濾法[15]、CO2超臨界萃取法[16]、超聲波法[17]以及酶水解法[18]等，但有關芝麻香型白酒酒醅中游離阿魏酸提取的研究還很有限。

我國白酒有十二大香型，其中就包括芝麻香型。芝麻香型白酒是建國后始創于山東的創新香型，并且是魯酒中的典型代表。其酒體的香氣特殊，有類似于烘焙芝麻的氣味，而這也是芝麻香命名的由來。芝麻香的獨特風味主要是由其特殊工藝而來。芝麻香型白酒具有清蒸續糟、泥底磚窖、麩曲和大曲共用、多微共酵、高氮配料、高溫堆積、高溫發酵、高溫餾酒、發酵周期長、長期儲存的工藝特點[19-22]。近年來，對芝麻香型白酒發酵過程中微生物多樣性的研究較多[23-27]，但對酒醅發酵過程中非揮發性風味物質的研究較少。

本研究以芝麻香型白酒酒醅為研究對象，采用浸提法提取酒醅中的游離阿魏酸，以游離阿魏酸提取量為評價指標，考察甲醇體積分數、料液比、提取時間以及提取溫度對酒醅中游離阿魏酸提取量的影響。在單因素試驗的基礎上，結合Plackett-Burman試驗和響應面Box-Benhnken試驗設計優化游離阿魏酸提取工藝，以期為芝麻香型白酒酒醅中游離阿魏酸的提取提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

芝麻香型白酒酒醅（芝麻香手工釀造班組入池酒醅）：濟南趵突泉釀酒有限責任公司。

阿魏酸（純度99%）：上海麥克林生化科技有限公司；甲醇、乙腈（均為色譜純）：美國TEDIA天地試劑公司。

1.2 儀器與設備

1220 Infinity高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀：美國安捷倫科技有限公司；FA2004精密電子天平：天津天馬衡基儀器有限公司；LGJ-18A真空冷凍干燥機：北京四環科學儀器廠有限公司；FW-100高速萬能粉碎機：北京市永光明醫療儀器有限公司；UPR超純水機：四川優普超純科技有限公司；KQ2200E超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；TDL-5-A離心機：上海安亭科學儀器廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 酒醅游離阿魏酸含量測定

阿魏酸含量測定采用高效液相色譜法。

（1）高效液相色譜分析條件

參考文獻[28]測定酚酸類成分的液相色譜方法，并進行了適當的調整。HPLC色譜條件如下：ZORBAX Eclipse XDB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫35 ℃；流速1.0 mL/min；進樣量10 μL；流動相為乙腈-0.09%磷酸（17∶83，V/V）；等度洗脫，檢測波長316 nm。

（2）對照品溶液的配制

準確稱取0.010 5 g阿魏酸對照品，置于100 mL棕色量瓶中，加入體積分數為50%甲醇溶液，稀釋至刻度，配制質量濃度為105 mg/L的阿魏酸對照品儲備液。移液管準確吸取對照品貯備液5 mL，置于50 mL量瓶中，加入體積分數為50%甲醇溶液，稀釋至刻度，搖勻，得質量濃度為10.5 μg/mL游離阿魏酸對照品使用液。

（3）供試品溶液的配制

準確稱取干燥酒醅樣品1.0 g，置于50 mL離心管中，加入30 mL體積分數為50%甲醇溶液，振蕩混勻，超聲波法（超聲功率100W、超聲頻率40 kHz）50℃超聲20 min，4000 r/min離心10 min，取上清液，用0.45 μm濾膜過濾，得到供HPLC分析的樣品供試液。

（4）標準曲線的繪制

用體積分數為50%的甲醇稀釋阿魏酸對照品使用液，分別配制成0.315 μg/mL、0.525 μg/mL、1.050 μg/mL、2.100 μg/mL、5.250 μg/mL系列標準阿魏酸溶液，并在優化色譜條件下分別測定3次，并取平均值。以阿魏酸質量濃度（x）為橫坐標，峰面積（y）為縱坐標，繪制標準曲線，擬合線性回歸方程為：y=879.84x-10 548，相關系數為R2=0.999 8。

1.3.2 酒醅游離阿魏酸提取及其含量計算

取保存于-80 ℃冰箱的凍酒醅，冷凍干燥后，用粉碎機粉碎過60目篩，在設計的甲醇體積分數、料液比、提取時間以及提取溫度條件下，用超聲波法（超聲功率100 W、超聲頻率40 kHz）提取干酒醅中的游離阿魏酸。準確稱取1.0 g干酒醅樣品，置于50 mL離心管中，加入甲醇溶液加以混勻，超聲提取后，在4 000 r/min條件下離心10 min，離心后吸取上清液，用0.45 μm濾膜過濾，供HPLC分析。游離阿魏酸提取量計算公式如下：

式中：C為回歸方程計算出的游離阿魏酸含量，μg/mL；m為稱量干酒醅樣品質量，g；V為甲醇溶劑體積，mL。

1.3.3 酒醅游離阿魏酸提取工藝優化

（1）單因素試驗

選取甲醇體積分數、料液比、提取時間以及提取溫度為自變量，以游離阿魏酸的提取量作為響應值。各因素的水平梯度設置：甲醇體積分數為30%、40%、50%、60%、70%；料液比為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g∶mL）；提取時間為5 min、10 min、15 min、20 min、25 min；提取溫度為30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃。

（2）Plackett-Burman試驗設計

在單因素試驗的基礎上，采用Plackett-Burma試驗設計對甲醇體積分數（A）、料液比（B）、提取時間（C）和提取溫度（D）共4個因素進行了評估。以游離阿魏酸的提取量為響應值，對每個因素取高水平和低水平值，篩選影響顯著的因子用于后續響應面試驗，重復3次。Plackett-Burman試驗的因素及水平見表1。

表1 Plackett-Burman試驗設計因素與水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman experiments design

（3）Box-Behnken響應面試驗設計

在Plackett-Burman試驗的基礎上，以甲醇體積分數（A）、料液比（B）、提取時間（C）、提取溫度（D）為自變量，以游離阿魏酸的提取量（Y）為響應值，采用Box-Behnken試驗設計考察各因素對游離阿魏酸提取量的影響程度，進而得出提取酒醅中游離阿魏酸的最佳工藝條件。Box-Behnken試驗設計因素與水平見表2。

表2 Box-Benhnken試驗設計因素與水平Table 2 Factors and levels of Box-Behnken experiments design

1.3.4 數據處理

所有試驗均重復3次，結果用“平均值±標準誤差”表示。試驗數據采用Excel 365和Origin 2019b進行分析和處理。使用Minitab19.1對Plackett-Burman試驗結果進行分析，用Design-Expert 12.0.3對響應面試驗進行設計與分析。

2 結果與分析

2.1 酒醅游離阿魏酸提取工藝優化單因素試驗

由圖1A可知，酒醅中游離阿魏酸提取量隨甲醇體積分數的增加先升高后降低，當甲醇體積分數為30%～60%時，阿魏酸提取量隨甲醇體積分數的增加而增高；當甲醇體積分數為60%時，阿魏酸提取量最高，為（93.18±0.03）μg/g，當甲醇體積分數＞60%之后，酒醅中游離阿魏酸的提取量反而降低，有可能是因為游離阿魏酸量已經達到了飽和，從而導致了酒醅中游離阿魏酸的提取量降低。因此，最適甲醇體積分數為60%。

由圖1B可知，酒醅中游離阿魏酸提取量隨料液比的增加先升高后降低，當料液比在1∶10～1∶30（g∶mL）時，阿魏酸提取量隨之增高，當料液比為1∶30（g∶mL）時，阿魏酸提取量最高，為（90.67±0.60）μg/g，當料液比在1∶30～1∶50（g∶mL）時，阿魏酸提取量隨之降低。這是因為料液比太小時，提取液密度大，甲醇溶劑與酒醅不能充分接觸，料液比繼續增大，酒醅中游離阿魏酸提取量反而減小，有可能是因為隨著料液比的增加，酒醅中的其他物質成分也隨著提取出來，造成游離阿魏酸提取量降低。因此，最適料液比為1∶30（g∶mL）。

由圖1C可知，隨著提取時間的延長，酒醅中游離阿魏酸提取量先升高后降低，當提取時間為5～10 min時，阿魏酸提取量隨之增高，在提取時間為10 min時，阿魏酸提取量最高，為（85.62±0.21）μg/g，當提取時間＞10 min之后，阿魏酸提取量隨之下降。因為提取時間可能過長，酒醅中的游離阿魏酸部分被氧化分解掉，從而導致提取量減少。因此，最適提取時間為10 min。

由圖1D可知，隨提取溫度的升高，酒醅中游離阿魏酸的提取量先增加后趨于平緩，當提取溫度為30～60 ℃時，阿魏酸提取量隨之增高，當提取溫度為60 ℃時，阿魏酸提取量最高，為（80.86±0.50）μg/g，當提取溫度＞60 ℃之后，阿魏酸提取量隨之下降。但是溫度不宜太高，如果溫度過高，阿魏酸的結構可能因熱作用而改變，含量會降低。因此，最適提取溫度為60 ℃。

圖1 不同因素對游離阿魏酸提取效果的影響Fig.1 Effect of different factors on the extraction effect of free ferulic acid

2.2 酒醅游離阿魏酸提取工藝優化Plackett-Burman試驗

Plackett-Burman試驗結果見表3，使用Minitab軟件對表4數據進行回歸分析和顯著性檢驗，結果見表4。由表4可知，甲醇體積分數（A）、提取時間（C）對酒醅中游離阿魏酸的提取量有極顯著影響（P＜0.01），料液比（B）、提取溫度（D）對酒醅中游離阿魏酸提取量有顯著影響（P＜0.05）。因此，選擇甲醇體積分數、料液比、提取時間以及提取溫度4個因素進行Box-Behnken試驗。

表3 Plackett-Burman試驗設計因素與水平Table 3 Factors and levels of Plackett-Burman experiments design

表4 Plackett-Burman試驗回歸分析結果Table 4 Regression analysis results of Plackett-Burman experiments

2.3 酒醅游離阿魏酸提取工藝優化Box-Behnken試驗

2.3.1 Box-Behnken試驗結果

在Plackett-Burman試驗基礎上，以甲醇體積分數（A）、料液比（B）、提取時間（C）、提取溫度（D）為自變量，以游離阿魏酸提取量（Y）響應值，優化酒醅中游離阿魏酸的提取工藝，采用Box-Behnke試驗設計及結果見表5，方差分析見表6。通過Design-Expert 12.0.3對表6數據進行多元線性回歸分析，得到二次多項式方程為：Y=91.75-1.18A+4.51B-2.04C+1.72D-1.79AB-0.791 4AC-0.9173AD-0.602 8BC-0.726 5BD-1.56CD-11.15A2-7.51B2-2.57C2-3.96D2

表5 Box-Behnken試驗設計與結果Table 5 Design and results of Box-Behnken experiments

由表6可知，模型F值=27.22，P值＜0.01，表明該模型極顯著，并且模型的失擬項（P值=0.848 7＞0.05）不顯著，表明所選模型具有良好的擬合度，能較好地擬合試驗結果。決定系數R2為0.962 6，調整決定系數R2Adj為0.929 1，表示該模型能夠解釋92.91%的阿魏酸含量變化，進一步表明回歸方程具有良好的擬合度。

表6 回歸模型方差分析Table 6 Variance analysis of regression model

續表

由P值可知，在模型中，一次項B、C、D，二次項A2、B2、C2、D2對結果影響極顯著（P＜0.01）；一次項A對結果影響顯著（P＜0.05），而其他項對結果影響不顯著（P＞0.05）。由F值可知，4個因素對游離阿魏酸提取量的影響大小依次為料液比（B）＞提取時間（C）＞提取溫度（D）＞甲醇體積分數（A）。

2.3.2 各因素交互作用對游離阿魏酸提取量影響的響應面分析

采用Design-Expert12.0.3軟件繪制各因素交互作用對結果影響的響應面及等高線見圖2。通過響應面及等高線可以直觀地分析各因素及因素之間的交互作用對游離阿魏酸提取量的影響[29]。響應面圖中曲線越是彎曲，表明研究因素對結果的影響就愈大，橢圓形等高線表示研究因素之間的交互作用明顯，圓形等高線則表示交互作用不明顯。每條曲線上的提取質量是相同的，圖形顏色從藍色到紅色表示提取質量由少變多，顏色變化越快，坡度越大，即對結果的影響越顯著。

由圖2可知，甲醇體積分數、料液比、提取時間和提取溫度中任意兩個變量取0水平時，其余兩個變量對酒醅中游離阿魏酸提取量的影響。三維響應面圖基本上是拋物形的，在曲面上有最高點，很容易出現最大值。從圖2可以看出，AB的響應面曲線最陡，等高線相對較緊密，因此AB的交互作用對酒醅中游離阿魏酸的提取量影響相對顯著；CD的交互作用對酒醅中游離阿魏酸的提取量也有一定的影響；AC、AD、BC和BD的響應曲面相對平坦，等高線松散，表明AC、AD、BC和BD的交互作用對酒醅中游離阿魏酸提取量的有較小的影響。交互作用對酒醅中游離阿魏酸提取量的影響順序為：AB＞CD＞AD＞AC＞BD＞BC。

圖2 各因素交互作用對游離阿魏酸提取效果影響的響應面及等高線Fig.2 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factor on the extraction effect of free ferulic acid

2.3.3 最佳條件的預測及驗證試驗

通過回歸模型預測得到芝麻香型白酒酒醅中游離阿魏酸的提取最佳工藝為：甲醇體積分數59.28%、料液比1∶33.152（g∶mL）、提取時間7.432 min以及提取溫度62.984 ℃。此時酒醅中游離阿魏酸提取量理論值為93.285 μg/g。考慮到試驗的客觀條件以及操作簡便性，因此改進后的最佳條件為：甲醇體積分數60%、料液比1∶30（g∶mL）、提取時間7.5 min、提取溫度63 ℃。在此最佳提取工藝條件下進行3次平行驗證試驗，酒醅中游離阿魏酸的提取量實際值為（91.50±2.99）μg/g，與預測值93.285 μg/g誤差值為1.91%，說明試驗所得數學模型可以較好的預測各因素和評價指標之間關系，適用于該酒醅游離阿魏酸提取工藝優化。

3 結論

通過單因素試驗和Plackett-Burman試驗設計及Box-Behnken試驗設計，確定酒醅中游離阿魏酸提取過程中的各個因素對游離阿魏酸提取量的影響力大小依次為甲醇體積分數＞提取時間＞提取溫度＞料液比。最佳提取工藝條件為：甲醇體積分數60%、料液比1∶30（g∶mL）、提取時間7.5 min、提取溫度63 ℃。在此最佳提取工藝條件下，游離阿魏酸提取量實際值為（91.50±2.99）μg/g，較優化前提高13%。實測值與理論值總體吻合，說明模型可以較好的預測響應值，優化條件可靠，具有實際應用價值。