Maresin1對糖尿病大鼠腎臟損傷的保護作用及機制研究

李 澤，單 偉，姜 東

(錦州醫科大學基礎醫學院解剖學教研室，遼寧 錦州 121001)

糖尿病腎病(Diabetes kidney disease，DKD)是常見的糖尿病微血管并發癥，也是全球終末期腎病的主要原因[1-2]。DKD沒有特異性治療方法，預后通常較差。因此，有必要進一步探索DKD的病理生理機制和臨床治療策略。高血糖誘導的血管功能障礙是DKD的主要起始機制，但其進展也由一組異質性病理機制驅動，包括炎癥、氧化應激和纖維化等[3]。研究[4]發現，針對炎癥機制進行干預可有效防治DKD。由巨噬細胞合成的Maresin1具有強大的抗炎及消退炎癥作用，對多種疾病(如肺部疾病、肝臟疾病、血管疾病、膿毒癥等)均具有較好的療效[5-6]。有文獻[7]報道，DKD受試者血液中Maresin1明顯低于對照組。此外，其可通過抑制中性粒細胞浸潤和增強膿毒癥急性肺損傷小鼠模型中的巨噬細胞吞噬作用來促進炎癥消退，從而減少急性肺損傷[8]。然而，Maresin1是否緩解DKD發生和發展尚未得到充分闡明。核因子-κB(Nuclear factor κB，NF-κB)/信號轉導和轉錄激活因子3(Signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)信號通路可以加重DKD炎癥反應，但Maresin1是否能調控NF-κB/STAT3進而改善DKD尚未見報道。因此，本研究利用SD大鼠糖尿病模型探索Maresin1對DKD的保護作用及相關機制，為臨床治療DKD提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級雄性SD大鼠40只，體重200～240 g，購自錦州醫科大學。適應性飼養3 d，禁食、禁水12 h。本實驗遵循國家《實驗動物管理條例》。

1.2 實驗方法

1.2.1 大鼠模型制備：單次腹腔注射鏈脲佐菌素(批號：S0130，Sigma公司)55 mg/kg，3 d后血糖≥16.7 mmol/L為成模。

1.2.2 大鼠分組：將大鼠分為四組，每組10只。對照組(Control組)不做任何處理；糖尿病組(DM組)為單純模型組；Maresin1預處理組(DM+Maresin1組)在成模8周后進行4 ng/g Maresin1(批號：10878-10,Cayman Chemical公司)腹腔注射給藥，每周2次[9]；DM+Maresin1+colivelin組在DM+Maresin1組基礎上給予STAT3激活劑colivelin(批號：HY-P1061A,MCE公司)2 mg/(kg·d)腹腔注射。

1.2.3 標本采集：12 周后，用戊巴比妥鈉(10 g/L)麻醉大鼠，在灌注固定前從心臟取血，留取血清用于血糖、血肌酐(Scr)和血尿素氮(BUN)和血清炎癥因子[腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-1β(IL-1β)、IL-6]檢測。大鼠采用4%多聚甲醛灌流1.5～2 h，取腎臟放于4 ℃固定液中48 h，進行常規石蠟包埋，用于HE染色、Masson染色和PAS染色(試劑盒批號：G1120、G1340、G1281，Solarbio公司)。同時，取大鼠新鮮腎臟組織進行Western blot檢測。

1.2.4 血清血糖、Scr和BUN檢測：采用全自動生化分析儀進行檢測。

1.2.5 血清炎癥因子水平檢測：將收集的上清在4 ℃條件下以12000 r/min離心20 min。按照酶聯免疫吸附試驗試劑盒(批號：SEKR-0009，Solarbio公司)說明書制作標準曲線并加樣品，以450 nm波長測光密度(OD)值。

1.2.6 HE染色：石蠟切片(5 μm)脫蠟后PBS洗3次，加蘇木素反應2 min，自來水沖洗。加伊紅反應1 min，自來水沖洗。脫水透明后封片，顯微鏡(BX53，Olympus公司)下拍照觀察。

1.2.7 Masson染色及PAS染色：石蠟切片(5 μm)脫蠟后，按照試劑盒說明書進行Masson和PAS染色，光鏡下觀察腎臟結構、腎臟纖維化、系膜基質增生程度。

1.2.8 相關蛋白Western blot檢測：采用BCA試劑盒測定蛋白濃度。電泳，轉膜，1% BSA封閉2 h。加入核NF-κB p65(1∶5000)、p-STAT3(1∶2000)、β-actin(1∶5000)于4 ℃孵育過夜。18 h后TBST洗膜，二抗(1∶5000)室溫孵育2 h，ECL顯影，用Image J軟件分析。

2 結 果

2.1 四組大鼠血糖、Scr及BUN水平比較 見圖1。與Control組相比，DM組血糖、Scr及BUN水平明顯增加(均P<0.05)。與DM組相比，DM+Maresin1組Scr及BUN水平明顯降低(均P<0.05)。與DM+Maresin1組相比，DM+Maresin1+colivelin組Scr及BUN水平有所增加(均P<0.05)。 然而，DM組、DM+Maresin1組和DM+Maresin1+colivelin組血糖比較差異無統計學意義(均P>0.05)。

注：與Control組相比，*P<0.05，▲P<0.01；與DM組相比，#P<0.05；與DM+Maresin1組相比，△P<0.05

2.2 四組大鼠腎臟組織HE染色結果 見圖2。Control組腎組織結構完整、清晰，未見明顯損傷性改變。DM組和DM+Maresin1+colivelin組可見腎小球肥大，腎小管明顯擴張，間質散在炎性細胞浸潤。DM+Maresin1組腎組織損傷程度較DM組和DM+Maresin1+colivelin組減輕。

Control組 DM組 DM+Maresin1組 DM+Maresin1+colivelin組

2.3 四組大鼠Masson染色結果 見圖3。Control組腎小球、腎小管結構未見異常。DM組和DM+Maresin1+colivelin組可見腎小管間質和腎小球周圍呈現膠原堆積，均存在明顯的纖維化現象。與DM組相比，DM+Maresin1組腎小管間質的纖維化程度降低。

Control組 DM組 DM+Maresin1組 DM+Maresin1+colivelin組

2.4 四組大鼠PAS染色結果 見圖4。Control組腎小球、腎小管結構未見異常。DM組和DM+Maresin1+colivelin組可見大量糖原沉積，提示系膜基質增生。與DM組相比，DM+Maresin1組的上述變化減輕。

Control組 DM組 DM+Maresin1組 DM+Maresin1+colivelin組

2.5 四組大鼠腎組織NF-κB/STAT3通路相關蛋白表達水平比較 見圖5。與Control組相比，DM組NF-κB p65及p-STAT3表達明顯增加(均P<0.05)。與DM組相比，DM+Maresin1組NF-κB p65以及p-STAT3明顯降低(均P<0.05)。與DM+Maresin1組相比，DM+Maresin1+colivelin組NF-κB p65及p-STAT3有所增加(均P<0.05)。

注：左圖為電泳圖。與Control組相比，*P<0.05，▲P<0.01；與DM組相比，◇P<0.01，#P<0.05；與DM+Maresin1組相比，△P<0.05

2.6 四組大鼠血清炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平比較 見圖6。與Control組相比，DM組TNF-α、IL-1β、IL-6水平明顯增加(均P<0.05)。與DM組相比，DM+Maresin1組TNF-α、IL-1β、IL-6水平明顯降低(均P<0.05)。與DM+Maresin1組相比，DM+Maresin1+colivelin組TNF-α、IL-1β、IL-6水平有所增加(均P<0.05)。

注：與Control組相比，*P<0.05，▲P<0.01；與DM組相比，#P<0.05；與DM+Maresin1組相比，△P<0.05

3 討 論

炎癥是對抗身體感染和損傷的重要防御機制，但過度不受控制的炎癥反應可導致自身組織細胞的非特異性殺傷。為了限制炎癥的過度發展，促進炎癥的及時消退，機體內部會產生一系列抗炎的脂質介質，這些介質又稱炎癥的“剎車信號”。腎臟是糖尿病最常受累的器官之一，DKD是糖尿病患者死亡風險增加的獨立危險因素[10-11]。

本實驗結果表明，DM組腎組織損傷明顯，血清中血糖、Scr和BUN水平升高，血清中炎癥因子明顯增加，表明DKD模型建立成功，這為后續實驗奠定了基礎。

由巨噬細胞合成的Maresin1是一種廣泛的抗炎劑，在多種急性和慢性炎癥疾病中起作用[12-13]。本究表明，Maresin1降低了糖尿病大鼠模型中的Scr及BUN水平，但對血糖的調節無明顯效果。此外，應用HE染色檢測腎臟病理結果顯示，糖尿病大鼠腎小球肥大，腎小管明顯擴張，間質散在炎性細胞浸潤，而Maresin1治療后以上腎組織損傷程度均較DM組減輕。Masson染色和PAS染色也顯示，腎小管間質和腎小球周圍呈現膠原堆積，糖原沉積，存在明顯纖維化及系膜基質增生，而Maresin1治療后以上變化均較DM組減輕。研究[14]證實，Maresin1具有控制炎癥性疾病的能力，這在很大程度上與其能夠減少幾種促炎細胞因子的能力有關。本研究也發現，Maresin1治療后糖尿病大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平明顯降低。以上結果顯示，Maresin1對糖尿病大鼠的腎臟損傷具有較好的抑制作用。

NF-κB活化是炎癥級聯反應在糖尿病腎病發展中的關鍵機制[15-16]。NF-κB的磷酸化釋放NF-κB p50/p65亞基，導致靶基因的核積累和轉錄調控。Maresin1可抑制NF-κB的活化，表現出強大的抗炎活性[17]。在正常情況時，NF-κB是與抑制劑IκB結合存在于細胞質中的無活性三聚體，沒有調節基因轉錄的功能。當細胞受到刺激時，它們誘導NF-κB激酶活化，其降解IκB并磷酸化p65亞基并將其轉移到細胞核中[18-19]。以前的研究描述了Maresin1在抑制不同動物模型NF-κB激活中的作用。在本項研究中，我們通過Western blot檢測了NF-κB p65的表達，p65是NF-κB途徑下游的關鍵活性因子，在腎臟組織中NF-κB p65表達明顯增加，而Maresin1處理后有效抑制了p65的磷酸化。此外，在Maresin1處理后，大鼠血清中的炎性細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6隨著NF-κB的抑制而改變。ELISA結果顯示，Maresin1治療顯著降低了糖尿病大鼠中促炎細胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6的水平，這表明Maresin1對糖尿病大鼠的保護作用可能至少部分與NF-κB途徑的抑制有關。

STAT3蛋白參與各種生理功能的調節，如凋亡、炎癥等[20]。STAT3是IL-6細胞內信號傳導的主要下游信號靶標，在IL-6介導的炎癥和免疫中起關鍵作用[21]。本研究表明，Maresin1可以通過降低IL-6表達和STAT3的磷酸化來發揮對糖尿病大鼠的腎臟保護作用。另外，Maresin1可以明顯抑制糖尿病大鼠腎臟中鏈脲佐菌素誘導的STAT3，這表明STAT3途徑可能與Maresin1對大鼠DKD的保護作用有關。為了進一步驗證STAT3在本研究中的作用，在給予Maresin1處理的同時，我們同時給予STAT3信號激活劑colivelin，結果發現Maresin1的保護作用被逆轉，這提示Maresin1對糖尿病大鼠的保護作用與抑制STAT3密切相關。

綜上所述，Maresin1通過抑制NF-κB/STAT3信號通路誘導的炎癥反應，對鏈脲佐菌素誘導的DKD大鼠發揮腎臟保護作用。該結果為DKD患者發現了一種新的基于Maresin1的治療方法。然而，Maresin1對DKD的保護作用機制復雜，在后續的科研工作中我們將從蛋白互作的角度繼續探討Maresin1對NF-κB/STAT3的直接調控機制。