裸鼠肺腺癌移植瘤組織中缺氧誘導因子-1α蛋白、血清蛋白和淋巴管內皮細胞透明質酸受體1蛋白表達及意義

孔凡龍，吳 寶，信洪武(美國)，白玉勤

(1.錦州醫科大學，遼寧 錦州 121001；2.赤峰學院基礎醫學院組織學與胚胎學教研室，內蒙古 赤峰 024000；3.長江大學醫學部分子醫學中心腫瘤學研究室，湖北 荊州 434023；4.赤峰學院醫學院分子醫學中心，內蒙古 赤峰 024000；5.赤峰市腫瘤醫院 赤峰學院第二附屬醫院病理科，內蒙古 赤峰 024000)

在動物切除組織的標本制作過程中，傳統方法制備標本時容易產生人工假象[1]。活體冷凍技術(In vivo cryotechnique，IVCT)是日本山梨大學野伸一教授所研究開發的技術，反映的是活體狀態下細胞和組織的形態、結構和功能，克服了傳統標本制作方法中缺血、缺氧所造成的缺陷[2]。我們第一次清晰地觀測到血清蛋白表達的分布情況，是應用IVCT技術在異種移植人非小細胞肺癌(Non-small cell lung cancer，NSCLC)模型上，提出了不同分子量的血清蛋白在細胞外基質的表達不同，闡明了功能性血管與血清蛋白、血管生成因子的密切關系[3-4]。據文獻[5]報道，缺氧誘導因子-1α(Hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)蛋白表達與NSCLC患者血管生成及預后不良密切相關。腫瘤細胞蛋白表達與腫瘤細胞異質性有關[6]。但是我們的前期研究證明，在大細胞肺癌移植瘤組織中HIF-1α蛋白表達與功能性和非功能性血管數目無關，而與腫瘤細胞異質性有關。為了進一步研究肺腺癌移植瘤組織中HIF-1α蛋白與血管生成和侵襲轉移關系，開展了本研究。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 購自日本SLC株式會社的7～8周裸鼠(BALB/c-nu/nu)20只。動物模型建立和飼養在日本山梨大學動物實驗室的SPF條件下進行。本實驗由日本山梨大學動物保護與使用委員會批準同意。

1.2 肺癌細胞系 A549細胞株由日本東北大學生物醫學研究所提供[7]。在日本山梨大學醫學部解剖組胚室的細胞培養室，以含20%小牛血清的RPMI-1640培養液對A549細胞進行培養[3-4]。

1.3 主要試劑 北京中杉金橋生物技術有限公司生產的羊抗鼠血清蛋白(批號：ZA16388和20062916)、兔抗人HIF-1α(批號：20101991)、顯色劑二氨基聯苯胺(DAB)試劑盒(批號：221020513)；英國Abcam公司生產的兔抗鼠淋巴管內皮細胞透明質酸受體1(Lymphatic vessel endothelial hyaluronic acid receptor-1，LYVE-1)單克隆抗體(批號：615-478-250)；美國Invitrogen公司生產的細胞核TOPRO-3染色試劑(批號：815-361-120)；與第一抗體種屬匹配的第二抗體是Alexa 488和Alexa 546標記的兔抗羊IgG(批號：645-320-111和981-456-715)，購自美國Invitrogen公司；福州邁新生物技術開發公司生產的羊抗兔IgG(批號：220324S409b)。

1.4 腫瘤移植 收集傳代培養后的A549細胞約5×106個，接種到裸鼠背部皮下。接種后每周2次使用電子天平稱量裸鼠體重，觀察裸鼠進食、飲水以及腫瘤的生長情況，應用游標卡尺測量腫瘤長徑和短徑并記錄。腫瘤體積為1000 mm3時準備制備標本[4]。

1.5 標本制備 IVCT制備標本順序[4]：乙醚麻醉裸鼠→背部皮膚剪開→呈現移植瘤→移植瘤被液氮里制冷的異戊烷-丙烷冷凍液(-193 ℃)瞬間冷凍固定→移植瘤在液氮里用牙科電鉆取下→干冰(-80 ℃)預冷的2%多聚甲醛-丙酮液冷凍置換[2]。冷凍置換逐漸升溫順序：2%多聚甲醛-丙酮液的冷凍標本-193 ℃→-80 ℃→-20 ℃→-10 ℃→-4 ℃→室溫。聚乙二醇和聚乙烯醇的水溶性混合物和石蠟包埋移植瘤組織，用冰凍切片機和石蠟切片機進行切片，染色后在光學和熒光顯微鏡下觀察。

1.6 HE與免疫組織化學(IHC)染色 含MAS的黏附載玻片上黏附3 μm厚度的連續石蠟切片。一部分切片進行HE染色，一部分切片用于IHC染色。IHC染色采用ABC法。IHC染色順序：脫蠟(二甲苯)→水化(梯度乙醇)→PBS清洗→1%過氧化氫阻斷內源性過氧化物酶活性→2%魚明膠溶液封閉→PBS漂洗3次→分別滴加一抗羊抗鼠血清白蛋白(Albumin)、免疫球蛋白M(IgM)、HIF-1α和LYVE-1單克隆抗體→4 ℃冰箱孵育(過夜)→PBS液3次沖洗→羊抗兔IgG或者Alexa 488、546二抗→滴加細胞核染色用的TOPRO-3試劑→室溫孵育1 h。用蘇木精和甲基綠染色DAB顯色的細胞核，水化(梯度乙醇)后二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。每次染色均采用空白對照(PBS)和自身陽性對照。陽性對照是在同一切片上與試驗對象比較，血管腔和間質中的Albumin應為陽性，免疫細胞質或血管腔中的IgM應為陽性，HIF-1α在腫瘤細胞膜漿、核內應為陽性，LYVE-1在淋巴管內皮細胞漿應為陽性。判斷標準：根據IHC染色程度，分為強陽性()、中等陽性()和弱陽性(+)，無染色為陰性(-)。在同一切片中統計分析A549肺腺癌細胞異種移植瘤組織(包括血管、腫瘤基質和腫瘤細胞外基質)中的Albumin和IgM蛋白表達水平。癌細胞細胞核或細胞質中的HIF-1α蛋白呈棕色顆粒狀染色為陽性，無染色為陰性。淋巴管內皮細胞胞漿或細胞膜中LYVE-1蛋白呈棕色為陽性，未染色為陰性。血管腔內Albumin和IgM蛋白呈中-強度陽性，此血管周圍細胞外基質IgM蛋白呈陰性，判定為功能性血管。LYVE-1蛋白在內皮細胞呈陽性則判定為淋巴管。計數功能性血管和淋巴管時，用低倍數物鏡觀察，再用高倍數物鏡隨機數10個視野，計算平均值，計算功能血管和淋巴管密度(個/HPF，HPF為高倍視野)。

2 結 果

2.1 A549移植瘤組織HE染色和HIF-1α蛋白IHC染色結果 見圖1。在HE切片上，腺癌浸潤組織中可見擴張的血管和血管內的紅細胞。在IHC切片上，HIF-1α蛋白陽性細胞在腫瘤周圍和間質某細胞漿呈棕黃色著色，而腫瘤細胞無著色，即HIF-1α蛋白在侵襲部位和非侵襲部位腫瘤細胞中均呈陰性表達。

圖1 A549移植瘤組織HE染色(A)和HIF-1α蛋白IHC染色(B)結果(×200)

2.2 A549移植瘤組織Albumin和IgM蛋白染色結果 見圖2、3。Albumin在血管、癌周纖維結締組織和細胞外基質中呈強陽性至中度陽性。在侵襲部位，腫瘤周圍血管和結締組織中的IgM蛋白呈中度陽性，而癌細胞的細胞外基質中為陰性；在非侵襲性組織部位，血管和腫瘤細胞外基質中IgM蛋白呈強陽性至中陽性。此外，在雙免疫熒光染色中，Albumin在血管、癌周圍纖維結締組織和細胞外基質中呈中強陽性(綠色)，IgM蛋白在血管和癌周圍纖維結締組織中呈中陽性(紅色)，在癌周圍細胞外基質中呈陰性。在A549移植瘤侵襲組織內部，IgM蛋白除了在免疫細胞漿呈強陽性外，在血管腔內與Albumin蛋白共同陽性表達(功能性血管)。半定量分析顯示，每標本同一部位連續10張切片的A549移植瘤侵襲組織Albumin和IgM蛋白呈陽性的功能性血管密度高于非侵襲組織[(14.80±1.03)個/HPF與(3.50±0.53)個/HPF，P<0.01]。

2.3 A549移植瘤組織LYVE-1蛋白染色結果 見圖4。LYVE-1蛋白在肺腺癌侵襲組織和非侵襲組織淋巴管內皮細胞漿呈深棕黃色顆粒狀著色，為強陽性表達。LYVE-1蛋白呈強陽性的淋巴管呈不規則形狀，管壁薄，內含淋巴液和淋巴細胞。LYVE-1蛋白還在某梭形細胞漿呈淺棕黃色顆粒狀著色，為弱陽性表達。半定量分析結果顯示，每標本同一部位連續10張切片的A549移植瘤侵襲組織LYVE-1蛋白呈陽性的淋巴管密度高于非侵襲組織[(25.90±4.43)個/HPF與(3.60±0.52)個/HPF，P<0.01]。

3 討 論

局部侵襲是影響惡性腫瘤如甲狀腺乳頭狀癌[8]、肺腺癌[9]、結直腸癌[10]、膀胱尿路上皮癌[11]等患者預后的主要病理基礎。在基礎醫學和臨床醫學切除的組織制備石蠟或冷凍切片標本過程中，由于血流中斷或標本的化學固定和乙醇脫水等步驟會導致組織收縮、分子易位和抗原封蔽等人工假象的產生[12]。IVCT技術能瞬間冷凍固定器官、組織、細胞，防止傳統方法制備標本的人工假象[1-4]。我們首次通過異種移植A549細胞模型，明確IVCT制備的NSCLC標本HE染色侵襲性組織的組織學特征，并結合Albumin、IgG1和IgM免疫組化染色分析[13]，得出Albumin、IgG1和IgM蛋白在非小細胞肺癌侵襲性組織中的表達及分布差異明顯的結論，進一步說明在腫瘤細胞外基質的Albumin(分子量約67 kDa)、IgG1(分子量約170 kDa)和IgM(分子量約9700 kDa)蛋白表達可能與其分子量密切相關，反映了非小細胞肺癌侵襲組織中腫瘤細胞之間復雜的相互作用引起的局部微環境的變化。該研究[13]還表明，A549異種移植瘤組織中細胞外基質Albumin、IgG1和IgM的免疫組化染色分布與VEGF和表皮生長因子受體(EGFR)的表達無關。另外，還報道了EphA7蛋白表達與肺腺癌侵襲進展無明顯關系，Ki67蛋白表達可能會影響肺腺癌侵襲[9]。本研究進一步證明了A549細胞株移植瘤非侵襲組織血管、腫瘤間質、細胞外基質Albumin和IgM蛋白均陽性表達，與Albumin和IgM蛋白分子量無關。

HIF-1α是第一個被證實參與調控VEGF轉錄的因子。HIF-1α是HIF-1的活性亞基，是一種異源二聚體(bHLH-PAS)，包含堿性螺旋-環-螺旋結構和PAS(Per/Amt/Sim)結構，與炎癥和腫瘤血管生成等相關[14-15]。HIF-1α蛋白表達與肺鱗狀細胞癌和腺癌(非小細胞肺癌)組織的血管形成和VEGF蛋白表達相關[5]。但我們研究發現在大細胞肺癌移植瘤組織中HIF-1α蛋白與血清蛋白、VEGF、Ki67蛋白表達無關，且與功能性血管數量多少無關[6]。為了進一步研究分析HIF-1α蛋白在移植瘤肺腺癌組織的功能性血管和淋巴管生成及侵襲的關系，我們開展了本次研究。

在本研究中，通過HIF-1α蛋白免疫組化分析發現A549移植瘤侵襲和非侵襲組織癌細胞均陰性表達，腫瘤間質淋巴細胞和巨噬細胞HIF-1α蛋白陽性表達，這與文獻[16]報道結果相同。我們推斷，HIF-1α蛋白陰性表達可能與腫瘤細胞異質性有關，但是與A549移植瘤組織血清蛋白相關的功能性血管分布無關。移植瘤侵襲組織的功能性血管分布可能與血管結構、血清蛋白分子量和電荷、腫瘤微環境等有關[1，3-4]。

注：圖A為A549移植瘤組織HE染色結果(×100)；圖B為LYVE-1蛋白在淋巴管內皮細胞和某梭形細胞漿或細胞膜呈棕黃色顆粒狀著色(×100)；圖C為LYVE-1蛋白在侵襲組織組織淋巴管內皮細胞和某梭形細胞漿活細胞膜呈棕黃色顆粒狀著色(×600)；圖D為LYVE-1蛋白在非侵襲組織淋巴管內皮細胞和某梭形細胞漿或細胞膜呈棕黃色強著色(×600)

研究[4，17]表明，肺腺癌侵襲組織的功能性血管密度高于非侵襲組織，這可能與NSCLC VEGF蛋白表達相關，VEGF蛋白表達促進了腫瘤周邊部位功能性血管生成，并為腫瘤細胞侵襲和轉移奠定基礎。

除了功能性血管生成外，淋巴管生成也是腫瘤細胞侵襲和轉移所必需的。Skobe等[18]和沈小玥等[19]利用淋巴管內皮細胞的特異性標志物LYVE-1在乳腺癌、肺腺癌淋巴管增生和淋巴管不同分布進行了研究。我們利用IVCT技術對小鼠腸系膜淋巴結內皮細胞LYVE-1蛋白進行了免疫組織化學分析，首次發現了淋巴結邊緣竇內側和髓竇內皮細胞LYVE-1蛋白陽性表達，但是邊緣竇外側內皮細胞LYVE-1蛋白呈陰性表達[20]。本研究利用IVCT技術結合LYVE-1蛋白免疫組織化學染色技術研究了肺腺癌移植瘤侵襲和非侵襲組織中LYVE-1蛋白的表達，結果發現肺腺癌侵襲組織LYVE-1蛋白陽性的淋巴管密度高于非侵襲組織，該結果與沈小玥等[19]研究結果一致。并且，我們推斷該結果可能與VEGF蛋白表達有關[4]。

綜上所述，HIF-1α蛋白表達與肺腺癌侵襲和功能性血管、淋巴管密度無關，但是功能性血管和淋巴管密度與肺腺癌的侵襲、發展密切相關。