CXC趨化因子配體10在癲癇大鼠和細胞炎癥反應中的作用及機制研究

楊 謙，曹冰清，韓 征，薛延莉，康 濤

(陜西省人民醫院神經內科，陜西 西安 710068)

癲癇是一種常見的慢性神經系統疾病，表現為自發性反復發作。持續的癲癇發作能產生腦部持久性改變，并出現相應的神經生物學、認知、心理學以及社會等方面的后果，嚴重威脅著人類的健康[1-2]。雖然大多數癲癇患者可以通過目前的抗癲癇策略完全控制癲癇發作，但大約30%患者對可用的抗癲癇治療沒有反應，從而發展為難治性癲癇[3]。癲癇的發生給社會帶來了巨大的負擔，因此迫切需要提高對癲癇發生的分子機制的理解，從而制定有效的癲癇治療策略。

神經炎癥在癲癇發生中至關重要，臨床患者分析證明了炎癥關鍵介質的基因表達與癲癇患者的癲癇發作頻率間存在顯著相關性[4]。不同免疫介導的炎癥細胞因子被認為是神經可塑性變化、癲癇發作閾值降低和神經元間異常神經元放電延長的誘導劑[5]。因此，調節炎癥因子的表達可能為治療癲癇開辟新的思路。CXC趨化因子配體10(CXC chemokine ligand-10，CXCL10)作為一種趨化因子，參與多種炎癥和免疫反應。在以癲癇為常見表現的遺傳性疾病結節性硬化癥中，施用CXCL10抑制劑可降低癲癇發作頻率[6]。對兒童癲癇患者進行RNA-seq分析后發現，CXCL10 RNA表達上調[7]。然而，CXCL10在癲癇中的作用及機制尚不明確。Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)作為介導免疫與炎癥的重要分子，被認為能夠促進癲癇的發生[8]。一項臨床調查[9]顯示，癲癇患者中TLR4高表達，且其高表達水平與癲癇發作的持續時間延長和發作頻率增加有關。因此，TLR4也被認為是癲癇的新型標志物[10]。TLR4/核因子(Nuclear factor，NF)-κB是經典的炎癥信號傳導途徑，參與多種疾病的調節。研究[11]表明，抑制TLR4/NF-κB通路可預防鋰-毛果蕓香堿誘導的癲癇的發生。本研究旨在利用體內和體外癲癇模型探究CXCL10在癲癇中的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康成年10周齡雄性Sprague-Dawley大鼠20只，體重210～260 g，購自上海斯萊克實驗動物有限公司，許可證號：SCXK(滬)2012-0002。每籠2～3只，在室溫、自然光環境下給予充足的食物及水。

1.2 主要試劑 人神經母細胞瘤細胞株SH-SY5Y購自上海中橋新舟生物科技有限公司；DMEMF12培養基購自美國HyClone公司；氯化鋰、匹羅卡品、視黃酸、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒購自美國Sigma公司；SYBR?Premix Ex TaqTM Ⅱ購自大連寶生物工程有限公司； TRIzol試劑(批號：15596018)購自美國invitrogen公司；PVDF膜購自美國Millipore公司；山羊抗小鼠IgG(批號：ab150113)和辣根過氧化物酶偶聯的山羊抗兔IgG(批號：ab150077)購自美國Abcam公司；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、顯色試劑盒購自上海碧云天生物技術公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 大鼠分組與癲癇模型制備：將20只大鼠隨機分為對照組和模型組，每組10只。模型組大鼠腹腔注射氯化鋰127 mg/kg，每30 min重復給予匹羅卡品10 mg/kg，直到大鼠癲癇發作。對照組腹腔注射等體積0.9%氯化鈉溶液。在癲癇持續狀態開始后約60 min，注射安定10 mg/kg以終止癲癇持續發作。隨后對大鼠進行安樂死，剖取顳葉組織凍存。

1.3.2 癲癇細胞模型制備：用DMEMF12培養基培養SH-SY5Y細胞(空白組)，視黃酸(RA)處理7 d誘導SH-SY5Y細胞分化，無鎂細胞液處理3 h誘導細胞發電，建立癲癇細胞模型(SH-5Y5Y組)。

1.3.3 癲癇模型細胞轉染及干預：按照LipofectamineTM3000說明書將過表達空白載體(pcDNA3.1)、CXCL10過表達載體(pcDNA3.1-CXCL10)、干擾陰性對照(si-RNA)和CXCL10干擾RNA (si-CXCL10)分別轉染至SH-SY5Y細胞中。在TLR4抑制劑TAK-242和激動劑脂多糖(LPS)處理實驗中，按照LipofectamineTM3000說明書將si-RNA和si-CXCL10轉染至SH-SY5Y細胞中，24 h以后使用TAK-242(si-CXCL10+TAK-242組)和LPS(si-CXCL10+LPS組)處理12 h，然后各組細胞置于37 ℃、5% CO2條件下繼續培養，進行后續試驗。

1.3.4 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測CXCL10基因表達：利用TRIzol試劑提取總RNA，將RNA反轉錄為cDNA。根據Genbank數據庫公布的基因序列，利用Primer 5.0軟件設計PCR引物。CXCL10正向引物序列為5’-TGAGAGCGAACATCCCAACAA-3’,反向引物序列為5’-TGTCCCCACGATCTTCATCTT-3’，GAPDH為內參基因。qRT-PCR反應體系：cDNA模板2 μl，上正反向引物各0.5 μl，SYBR?Premix Ex TaqTM Ⅱ 10 μl，無菌去離子水7 μl。反應條件：95 ℃預變性1 min；95 ℃變性 30 s，59 ℃退火1 min，72 ℃延伸40 s，共 30 個循環。同一實驗重復3次，通過2-△△Ct計算相對表達量。

1.3.5 免疫印跡法檢測TLR4和NF-κB p-p65/p65蛋白表達：用含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液提取顳葉組織或細胞蛋白。采用BCA法測定蛋白濃度并進行歸一化處理。將樣品上樣到加樣孔內進行SDS-PAGE電泳，被分離的蛋白繼續轉移到PVDF膜上進行轉膜。使用5%脫脂奶粉封閉蛋白，加入一抗孵育過夜。用TBST清洗后，加入二抗孵育1.5 h。使用化學發光底物可視化條帶，利用凝膠圖像處理系統分析目標條帶。

1.3.6 ELISA法檢測炎癥因子水平：將收集的細胞培養液置于4 ℃離心機中，以1000 r/min離心20 min，取上清液為待測樣品備用。按照ELISA 試劑盒說明書進行檢測，每個樣品設3個復孔，顯色后用酶標儀在450 nm波長處測量各孔光密度(OD)值，繪制標準曲線，計算各組樣品中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素(IL)-6和IL-8水平。

2 結 果

2.1 兩組大鼠及兩組細胞CXCL10 mRNA表達水平比較 見圖1。模型組大鼠CXCL10 mRNA表達水平高于對照組(P<0.05)。SH-5Y5Y組細胞CXCL10 mRNA水平高于空白組(P<0.05)。

注：左圖中，與對照組比較，*P<0.05；右圖中，與空白組比較，#P<0.05

2.2 癲癇細胞模型轉染后CXCL10 mRNA及炎癥因子表達水平比較 見圖2。過表達CXCL10升高SH-SY5Y細胞CXCL10 mRNA表達水平，而抑制CXCL10降低了SH-SY5Y細胞CXCL10 mRNA表達水平(均P<0.05)。此外，過表達CXCL10使SH-SY5Y細胞培養液中TNF-α、IL-6和IL-8水平顯著上升，si-CXCL10使SH-SY5Y細胞TNF-α、IL-6和IL-8水平顯著下降(均P<0.05)。

注：與pcDNA3.1組比較，*P<0.05；與si-RNA組比較，#P<0.05

2.3 癲癇細胞模型轉染后TLR4和NF-κB蛋白表達水平比較 見圖3。過表達CXCL10促進了TLR4和NF-κB p-p65/p65蛋白表達，而敲低CXCL10可抑制TLR4和NF-κB p-p65/p65蛋白水平(均P<0.05)。

注：左圖為蛋白電泳圖。右圖中，與pcDNA3.1組比較，*P<0.05；與si-RNA組比較，#P<0.05

2.4 癲癇模型細胞經TLR4抑制劑和激動劑處理后炎癥因子表達水平比較 見圖4。與si-CXCL10組比較，經LPS處理的癲癇模型細胞TNF-α、IL-6、IL-8水平上升，而經TAK-242處理的癲癇模型細胞TNF-α、IL-6、IL-8水平顯著下降,LPS處理顯著逆轉了由si-CXCL10導致的炎癥因子水平的降低(均P<0.05)。

注：與si-RNA組比較，*P<0.05；與si-CXCL10組比較，#P<0.05

3 討 論

癲癇是常見的神經系統疾病之一，是一種大腦神經元異常電活動的慢性疾病，特征為無端反復發作的痙攣[12-13]。癲癇的發病機制十分復雜，包括氧脅迫、谷氨酸興奮毒性、鈣超載等[14]。從病理變化開始到癲癇發展以及癲癇持續過程會伴隨著基因表達改變、炎癥、蛋白質產生和連接變化，這些都可能是藥物抑制癲癇發生的目標[15]。越來越多的證據表明，炎癥在人類癲癇和癲癇實驗模型中起著至關重要的作用[16]。炎癥基因網絡的某些成分可能成為治療癲癇一個新的靶點。

CXCL10是一種參與多種炎癥和免疫反應的趨化因子。已有研究[17-18]表明，CXCL10廣泛參與各種神經系統相關疾病，如腦型瘧疾和阿爾茨海默病。降低CXCL10水平并服用阿托伐他汀可緩解腦瘧疾[19]。此外，在患創傷性腦損傷和神經退行性疾病的小鼠中CXCL10表達量較高[20]。然而，暫無確切的研究證明CXCL10在癲癇中的作用。最近的一項研究[21]發現，CXCL10在癲癇小鼠模型的側海馬膠質細胞中上調，并可能作為癲癇發生的潛在上游靶點。這提示CXCL10可能參與癲癇的進展。在本研究中，我們證明了CXCL10在體內和體外癲癇模型中表達水平均上調，而敲低CXCL10顯著抑制了癲癇細胞中炎癥細胞因子(TNF-α、IL-6、IL-8)的表達，降低了神經炎癥。

研究[22]表明，TLR4/NF-κB信號在神經系統疾病中具有重要作用并調節癲癇進展。抑制TLR4/NF-κB信號通路有助于促進BV-2小膠質細胞向M2型極化，從而發揮神經保護作用，抑制癲癇的發生[23]。此外，Kleen等[24]發現死亡細胞釋放的高遷移率族蛋白B1(HMGB1)可激活TLR4，導致大鼠模型和人類慢性癲癇發作，而抑制TLR4可以減輕癲癇發作。Iori等[25]也發現在動物模型中激活TLR4通路會增加癲癇發作的易感性。因此，靶向炎癥信號通路可能成為一種當前對癥療法中控制癲癇發作的補充方法，特別是在常規治療難以見效的癲癇形式中[26]。在本研究中，TLR4激活劑LPS顯著逆轉了由si-CXCL10導致的炎癥因子水平降低，而si-CXCL10和TAK-242的雙重抑制使炎癥因子水平達到最低。因此，我們認為CXCL10能夠通過TLR4/NF-κB信號通路影響炎癥細胞因子的表達。

綜上所述，CXCL10在體外和體內癲癇模型中的表達水平均顯著上升，低表達CXCL10通過抑制TLR4/NF-κB信號通路降低了炎癥細胞因子水平，從而在癲癇炎癥反應中發揮重要作用。本研究證明了CXCL10可能是一種治療癲癇的新靶點，為研究和治療癲癇提供了新的理論基礎。