沙利度胺對類風濕關節炎滑膜細胞及外周血單個核細胞分泌腫瘤壞死因子-α和血管內皮生長因子的影響及機制研究

楊 婧，何家銳，孫紅兵，劉劍平

(1.南充市中心醫院 川北醫學院第二臨床學院風濕免疫科，四川 南充 637000；2.南江縣人民醫院中醫內分泌科，四川 南江 635600；3.川北醫學院附屬醫院風濕免疫科，四川 南充 637000)

類風濕關節炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一種慢性自身免疫性疾病，以對稱性多關節腫痛為主要表現，基本病理變化為關節滑膜的慢性炎癥、血管翳形成，可導致關節軟骨和軟骨下骨的破壞，最終引起關節畸形和功能喪失，使患者喪失勞動力，給家庭和社會造成了極大的經濟負擔。RA的發病機制十分復雜，越來越多的研究[1-2]證明多種炎癥細胞因子參與其中并貫穿RA始終。研究[3-5]發現，在RA病變關節中有大量炎癥細胞浸潤，可釋放血管內皮生長因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)、白細胞介素(Interleukin，IL)-1、IL-6、IL-17、IL-37和腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)等多種細胞因子，促進滑膜細胞增殖、滑膜血管增生及關節破壞。目前，已研制出了多種靶向細胞因子類的生物制劑用于治療RA，靶向藥物可通過抑制RA的核心致炎因子或關鍵免疫細胞功能達到緩解RA病情的作用。其中，TNF-α抑制劑是現有證據較為充分、應用最早且最常用的治療RA的生物制劑，包括依那西普/注射用重組人Ⅱ型TNF受體抗體融合蛋白、英夫利西單抗、阿達木單抗、戈利木單抗等[6]。生物制劑的使用是RA治療史上的一個里程碑，但這類藥物價格昂貴，絕大多數患者不能堅持使用。沙利度胺(Thalidomide，THD)是一種常用的抗血管生成劑和免疫調節劑，可以通過調節機體免疫反應抑制TNF-α、VEGF等的釋放，發揮其抗炎作用[7]。大量臨床研究[8-9]表明，THD治療RA療效確切，但其具體作用機制尚不明確。本研究通過觀察THD對RA患者成纖維樣滑膜細胞(Fibroblast-like synoviocytes，FLS)增殖的影響以及對FLS和外周血單個核細胞(Peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)分泌TNF-α和VEGF的影響，探討其治療RA的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞標本 FLS標本取自本院明確診斷的7例RA患者的膝關節腔積液。PBMCs標本取自本院明確診斷的20例RA患者。所有患者診斷均符合2010年美國風濕病協會(ACR)和歐洲抗風濕病聯盟(EULAR)制定的RA分類標準。本研究標本采集經患者同意及醫院倫理委員會批準。

1.2 主要試劑 0.01 mol/L PBS磷酸鹽緩沖液購自北京中杉金橋生物技術有限公司；人淋巴細胞分離液購自天津灝洋生物制品科技有限公司；胰蛋白酶、脂多糖(LPS)、二甲基亞砜(DMSO)及臺盼藍購自美國Sigma公司；四甲基偶氮唑藍(MTT)購自美國R&D公司；RPMI1640培養基及DMEM-LG培養基購自美國Invitrogen公司；THD原料藥由江蘇常州制藥廠惠贈；四季青無支原體胎牛血清購自浙江天杭生物科技有限公司；TNF-α酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(貨號：EHC103a.48)及人VEGF ELISA試劑盒(貨號：EHC108.48)購自欣博盛生物科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 THD藥液配制：將THD原料藥充分溶解于DMSO配成濃度為50 mg/ml的儲存液，微孔濾器過濾除菌后分裝，-20 ℃保存。臨用時加入DMEM-LG培養液及RPMI1640培養液稀釋至所需濃度，終濃度為10、50、100、200、500 μg/ml。

1.3.2 FLS分離培養及THD刺激實驗：FLS分離自RA患者的關節腔積液，使用四季青無支原體胎牛血清培養液培養，經體外傳代培養獲得，用生長狀態良好的第3～5代FLS進行實驗。取對數生長期的FLS，按細胞密度為1×106個/ml、1 ml/孔接種于24孔細胞培養板中，培養24 h后洗掉懸浮細胞，加入含有不同濃度THD(0、50、100、200 μg/ml)的DMEM-LG培養液(含10%胎牛血清和LPS 5 μg/ml)，分別干預24、48 h后收集細胞液，在4 ℃條件下經低溫離心機以5000 r/min離心10 min，取上清液置于-80 ℃冰箱內保存備用。

1.3.3 PBMCs提取培養及THD刺激實驗：取肝素抗凝的RA患者外周靜脈血10 ml，應用淋巴細胞分離液梯度離心法獲取PBMCs。用移液管吸取該層細胞置于15 ml離心管中，用0.01 mol/L PBS洗滌細胞2次。用臺盼藍排斥試驗檢測細胞活力大于95%后調整細胞密度，按1×106個/ml、1 ml/孔接種于24孔細胞培養板中，每個標本設置8個孔，加入含有不同濃度THD(0、50、100、200 μg/ml)的DRPMI1640培養液(含10%胎牛血清和LPS 5 μg/ml)，置37 ℃二氧化碳恒溫培養箱培養24、48 h后收集細胞懸液。經4 ℃低溫離心機以5000 r/min離心10 min，取上清液置于-80 ℃冰箱內保存備用。

1.3.4 MTT法檢測FLS增殖水平：取處于對數生長期、生長狀態良好的FLS，用0.25%胰蛋白酶消化后制成5×104個/ml的細胞懸液，接種于96孔培養板，每孔100 μl。待細胞貼壁后，每孔分別加入濃度為10、50、100、200、500 μg/ml的THD溶液，同時設置LPS組(含LPS 5 μg/ml的DMEM-LG培養液)和對照組(不含LPS及THD)，每組設6次重復，分別于培養24、48 h后，每孔分別加入5 mg/ml的MTT液20 μl，置37 ℃二氧化碳恒溫培養箱繼續培養4 h。然后棄培養液，每孔分別加入150 μl DMSO，室溫下低速震蕩溶解，利用酶標儀在570 nm波長處測定各孔光密度(OD)值。

1.3.5 細胞形態學觀察：分別于加藥前及加入不同濃度藥物處理后的不同時間將細胞培養皿放置于倒置顯微鏡下觀察PBMCs和FLS的形態、大小、密度及生長情況變化。

1.3.6 ELISA法檢測細胞培養上清液中TNF-α、VEGF水平：收集不同濃度不同作用時間的THD刺激后FLS及PBMCs培養上清液，參照試劑盒說明書，采用 ELISA法檢測TNF-α及VEGF水平，實驗重復3次，取平均值。

2 結 果

2.1 FLS形態學變化 見圖1。鏡下觀察，分離的FLS培養24 h后開始貼壁，培養2～3 d后伸出生長突，呈梭形、多角形、極向排列。在含10%胎牛血清的DMEM-LG培養液中培養的FLS分裂增殖迅速，傳至第3代時獲得純化的呈梭狀FLS。不同濃度不同作用時間的THD對FLS進行干預后細胞形態也發生明顯改變，FLS貼壁能力減弱，開始出現突觸回縮，體積變小，細胞核出現固縮，由梭形變成圓形或不規則形，部分由貼壁變為懸浮。濃度為500 μg/ml的THD作用48 h時變化最明顯，細胞大量脫離，出現大量核固縮。

圖1 FLS傳至第3代(A)及THD 500 μg/ml干預48 h后(B)形態學變化(×200)

2.2 THD對FLS增殖的影響(MTT法) 見表1。LPS 5 μg/ml對FLS增殖無影響，10 μg/ml THD對FLS有增殖抑制趨勢，但與對照組比較差異無統計學意義(均P>0.05)。濃度范圍在50～500 μg/ml的THD干預FLS 24、48 h后，OD值低于對照組(均P<0.05)，表明FLS增殖受到抑制。

表1 THD對FLS增殖的影響

2.3 THD對FLS分泌TNF-α及VEGF的影響 見表2。THD 50、100、200 μg/ml 干預FLS 24、48 h后，TNF-α和VEGF濃度低于對照組(均P<0.05)，表明FLS分泌TNF-α及VEGF受到抑制。

表2 THD對FLS分泌TNF-α及VEGF的影響(pg/ml)

2.4 THD對PBMCs形態學及分泌TNF-α和VEGF的影響 見表3(圖2)。不同濃度THD(50、100、200 μg/ml)分別干預PBMCs 24、48 h后，PBMCs貼壁能力減弱，細胞核出現固縮，部分由貼壁變為懸浮。THD 50、100、200 μg/ml 干預PBMCs 24、48 h后TNF-α和VEGF濃度低于對照組(均P<0.05)，表明PBMCs分泌TNF-α及VEGF受到抑制。

表3 THD對PBMCs分泌TNF-α及VEGF的影響(pg/ml)

圖2 PBMCs干預前(A)及THD 200 μg/ml干預48 h后(B)形態學變化(×200)

3 討 論

THD是一種人工合成的谷氨酸衍生物，1956年以非處方藥的形式作為鎮靜劑首先在德國上市，隨后被廣泛用于治療孕婦的妊娠反應性嘔吐，之后因為嚴重致畸性于1961年撤出市場。但是學者們對THD的研究并未停止，近年來人們對THD又有了新的認識，研究發現該藥具有良好的抗炎、抗血管生成和免疫調節的作用，在臨床上被廣泛用于治療多種免疫相關性疾病及惡性腫瘤并取得良好療效，但其具體作用機制尚不明確。大量研究證實THD可抑制TNF-α、IL-6、VEGF等炎癥細胞因子的產生。眾所周知，腫瘤的生、長轉移與新生血管的生成密切相關，而腫瘤細胞分泌的VEGF在血管生成中發揮重要的作用。文獻[10-14]報道，THD在淋巴瘤、小細胞肺癌、食管癌、宮頸癌等疾病中均有抑制VEGF的作用，而且THD對VEGF分泌的抑制作用呈時間劑量依賴性。因此推測，THD主要通過抑制VEGF來達到抗腫瘤新生血管生成的目的，從而起到抗腫瘤的作用。THD還可抑制腫瘤細胞產生TNF-α[13，15]。THD聯合化療可進一步降低多發性骨髓瘤患者的VEGF、TNF-α和IL-6水平，從而證實了THD對多發性骨髓瘤有抑制VEGF、TNF-α和IL-6生成的作用[16]。在潰瘍性結腸炎、肺間質纖維化等疾病中，THD同樣可減低TNF-α的產生[17-18]。因此THD在臨床上常作為一種TNF-α抑制劑使用。

隨著對THD研究的不斷深入，其在治療風濕性疾病方面表現出巨大潛力，如RA、系統性紅斑狼瘡、白塞病、強直性脊柱炎和皮肌炎等[19]。THD治療銀屑病關節炎效果良好并可有效降低其血清VEGF水平，而其用于治療強直性脊柱炎也有十多年歷史并取得良好效果，可能得益于其對TNF-α的抑制作用及患者血清炎癥因子水平[20]。臨床研究證明，沙利度胺治療RA療效確切，但其治療RA的機制仍未明確。RA的發病機制與炎癥因子關系密切，VEGF和TNF-α是RA發病過程中最重要的兩種炎癥細胞因子，與RA滑膜血管增生和炎癥反應密切相關。血管增生在RA發病機制中起著重要作用，阻斷滑膜新生血管的形成可以有效緩解RA滑膜炎癥和血管翳的形成。在RA發病過程中慢性炎癥和血管增生是同時存在的，炎癥細胞因子(IL-6、IL-8、TNF-α、VEGF等)不僅可以直接誘導炎癥反應，還可以間接促進滑膜血管生成。THD不僅能夠減少VEGF的分泌，抑制血管生成，還可以有效阻礙 TNF-α等炎癥因子的釋放，進而起到抗炎作用。因此推測，THD治療RA可能與其抑制TNF-α及VEGF等炎癥細胞因子的分泌有關。

為了進一步探討THD治療RA的可能機制，本研究對RA FLS及PBMCs給予不同濃度THD干預，觀察THD對RA FLS的抑制作用及對FLS、PBMCs分泌VEGF和TNF-α影響，結果顯示THD濃度范圍在50～500 μg/ml，干預24、48 h對FLS增殖均有抑制作用。同時，本研究發現THD濃度在50～200 μg/ml范圍均能夠明顯抑制PBMCs和FLS分泌TNF-α、VEGF。

綜上所述，THD可能通過抑制RA患者 FLS增殖，抑制FLS及PBMCs分泌VEGF、TNF-α，減少新生血管的形成，減輕炎癥反應，從而起到治療RA的作用。但由于本研究所選取的標本數較少，得到的研究結果可能存在一定的局限性，其具體作用機制尚需進一步研究，以期能為THD臨床治療RA提供科學的指導和理論依據。