非洲豬瘟疫苗研制方向及進展

張振興，曾 毅，宋建領(lǐng)

（1.云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，云南省熱帶亞熱帶動物病毒病重點實驗室，云南昆明 650224；2.水富市兩碗鎮(zhèn)人民政府，云南水富 657803）

非洲豬瘟（African swine fever，ASF）是由非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）引起的一種生豬接觸性傳染病，急性死亡率能達到100%[1]。ASFV 隸屬于非洲豬瘟病毒科非洲豬瘟病毒屬，而且是該科屬的唯一成員，作為一種大型囊膜DNA 病毒，擁有異常龐大的雙鏈DNA 基因組，總長度170～190 kb[2]。此外，ASFV 具有上百個能編碼完成多肽鏈的開放閱讀框（open reading frames，ORF），不僅能編碼150 多種非結(jié)構(gòu)蛋白和結(jié)構(gòu)蛋白，甚至還能編碼免疫調(diào)節(jié)蛋白，調(diào)節(jié)先天免疫及細(xì)胞凋零等信號通路。截至目前，ASFV仍有幾十種蛋白質(zhì)未被鑒定分析出來[3]。

1921 年ASF 首次暴發(fā)于非洲東部的肯尼亞，此后的30 多年間ASFV 一直在非洲范圍內(nèi)傳播和蔓延，1957 年后相繼傳播到歐洲、美洲。直到20世紀(jì)90 年代中后期，除意大利撒丁島地區(qū)以外，歐洲其他地區(qū)以及美洲地區(qū)才消除了ASFV 的感染和侵襲[4]。2007 年，ASFV 蔓延到高加索地區(qū)的格魯尼亞等國家，此后迅速傳播到俄羅斯及東歐一些國家。2018 年8 月，ASFV 首次在我國遼寧省沈陽市被發(fā)現(xiàn)[5]，到2019 年底全國共報告發(fā)生ASF疫情162 起，撲殺生豬120 萬余頭[5]。至今，ASF疫情在我國仍呈散發(fā)態(tài)勢，并且我國周邊國家包括老撾、蒙古國、越南、朝鮮、柬埔寨等[6-8]也報道發(fā)生ASF 疫情。ASFV 已經(jīng)呈現(xiàn)出全球蔓延的趨勢，給各國生豬養(yǎng)殖者造成了嚴(yán)重的損失。因此，國內(nèi)外科研人員從多個方向致力于研發(fā)可以有效利用的ASFV 疫苗來應(yīng)對ASF 疫情。本文對不同研制方向的研究進展情況及難點進行綜述，以期對ASF疫苗研發(fā)提供參考。

1 滅活疫苗

滅活疫苗作為ASFV 疫苗研制的首選策略，其原理是通過加熱或者加入相應(yīng)的化學(xué)試劑等物理/化學(xué)方法，將人工培養(yǎng)的ASFV 殺死，使ASFV喪失原本應(yīng)有的感染能力和毒性，而只保留免疫原性，滅活后再結(jié)合相應(yīng)的非特異性免疫增強劑（佐劑）制成疫苗。ASFV 滅活疫苗雖然有價格低廉、制備工藝相比其他方式更加簡單便捷的優(yōu)勢，但是因為其在化學(xué)滅活或者物理滅活的過程中會喪失ASFV 本身應(yīng)有的感染力，只能引起生豬免疫應(yīng)答中的體液免疫，而無法引起細(xì)胞免疫，導(dǎo)致在生豬體內(nèi)產(chǎn)生的免疫應(yīng)答非常弱或者無法持久，更不能有效地對中和抗體產(chǎn)生誘導(dǎo)作用，從而導(dǎo)致滅活疫苗無法對生豬產(chǎn)生根本性的保護作用。研究人員將ASFV 感染后的豬肺泡巨噬細(xì)胞分成兩組分別進行戊二醛浸泡處理和洗滌劑浸泡處理，并將處理后的細(xì)胞再次注射入感染ASFV 的患病豬體內(nèi)進行觀察，但是免疫保護效果不甚理想[5]；隨著新技術(shù)的研發(fā)，也有通過其他方法，如通過進一步純化滅活病毒粒子，對ASFV 進行滅活加工處理，但是效果均不理想[9]；只有2014 年，Sandra 等[10]發(fā)表的論文指出，在滅活A(yù)SFV 得到的試劑中加入PolygenTM等佐劑，注入豬體內(nèi)后可應(yīng)答產(chǎn)生參與ASFV 內(nèi)化的p30 等特異性抗體，但遺憾的是加入佐劑的方法仍未誘導(dǎo)生豬產(chǎn)生根本有效的細(xì)胞免疫應(yīng)答。截至目前仍未發(fā)現(xiàn)ASFV 滅活疫苗研發(fā)獲得實質(zhì)性進展的報道，這可能與ASFV 復(fù)雜的免疫逃逸機制和成熟方式有關(guān)。

2 減毒活疫苗

ASFV 減毒活疫苗的研制分為兩種：一是ASFV 自然致弱活疫苗的研制，二是ASFV 重組致弱活疫苗（基因工程減毒活疫苗）的研制。其原理是經(jīng)過各種處理，讓ASFV 發(fā)生變異，使其既降低自身原有的毒性，又保留其免疫原性。二者的區(qū)別在于，ASFV 自然致弱活疫苗的研制是通過常規(guī)途徑，如細(xì)胞傳代培養(yǎng)、非宿主動物連續(xù)傳代等方式獲得致弱的毒株；ASFV 重組致弱活疫苗（基因工程減毒活疫苗）的研制是通過尋找和定位ASFV中與病毒毒力相關(guān)以及引起宿主應(yīng)答的基因，如ASFV 中的NL、TK、9GL、MCF 360/55等基因，把其敲除后再經(jīng)過一系列操作獲得的基因缺失弱毒株。ASFV 減毒活疫苗的研制優(yōu)勢很多，它既能誘導(dǎo)體液免疫，還能誘導(dǎo)細(xì)胞免疫；在生豬體內(nèi)起到長時間的免疫應(yīng)答作用；可以在豬場生豬群中水平傳播，使生豬群體獲得良好的免疫屏障等。通過總結(jié)前人研究，對二者進行比較發(fā)現(xiàn)，ASFV 重組致弱活疫苗（基因工程減毒活疫苗）的研制前景要好于ASFV 自然致弱活疫苗。Leit?o 等[11]通過豬骨髓細(xì)胞傳代培養(yǎng)獲得的天然減毒株NH/P68免疫豬群后，經(jīng)測試發(fā)現(xiàn)其對親代毒株的免疫保護率最高可達100%，但是對不同基因型ASFV 的交叉保護率不甚理想，有的只有66%，而且對豬群會產(chǎn)生一定的毒副作用，甚至有毒力返強的征象。Monteagudo 等[12]將ASFV 基因Ⅰ型的CD2V/ER402R基因敲除后獲得的ASFV 基因Ⅰ型Ba71 弱毒株免疫豬群后，不僅能夠?qū)τH代毒株產(chǎn)生良好的免疫應(yīng)答反應(yīng)，還能對不同基因型的ASFV，如ASFV 基因Ⅰ型E75、ASFV 基因Ⅱ型Georgia07 等ASFV 強毒株產(chǎn)生良好的免疫應(yīng)答反應(yīng)。這種交叉保護反應(yīng)是ASFV 自然致弱活疫苗所不能比擬的。

目前較有希望研制成功的ASFV 重組致弱活疫苗，是由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所以我國流行的ASFV 基因Ⅱ型HLJ/18 毒株為親本構(gòu)建的7 基因缺失重組疫苗，其在豬群中的動物試驗顯示，可以在豬群中做到100%減毒，而不會誘使產(chǎn)生ASFV 強毒株，同時能對目前存在的致死性ASFV 起到較高的保護作用[13]。此外，我國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所扈榮良教授團隊以我國流行ASF 毒株SY18 為親本成功構(gòu)建了能100%抵抗親本毒株攻擊的MGF和CD2v雙基因缺失株[14]，這也能證明ASFV 疫苗研究成功的方向或許在于ASFV 重組致弱活疫苗。

3 亞單位疫苗

ASFV 亞單位疫苗也被稱為ASFV 組分疫苗，即利用ASFV 上某種表面結(jié)構(gòu)成分，通過合成加工（化學(xué)分解、選擇性控制水解相關(guān)蛋白等方式），提取ASFV 特定的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，通過篩選獲得具有免疫原性的蛋白組分，研制成的一種本身不含有ASFV 核酸，但卻能誘發(fā)生豬產(chǎn)生免疫保護的一種疫苗。ASFV 亞單位疫苗和ASFV 重組致弱活疫苗一樣，也是利用基因工程方式，只是選取的基因相對會小很多，因而具有更高的生物安全性，但面臨的問題也有很多，如只能提供部分免疫保護、交叉保護效率低、無法產(chǎn)生中和抗體等。與ASFV內(nèi)化相關(guān)的蛋白p30，作為ASFV 最具有抗原性結(jié)構(gòu)蛋白之一，目前被廣泛應(yīng)用于各實驗室的ASFV血清學(xué)檢測中。但是單獨作為ASFV 亞單位疫苗的研究對象，即使可以在免疫豬群中產(chǎn)生中和抗體，也無力抵御ASFV 強毒株的攻擊，還可能造成免疫豬群出現(xiàn)強烈的病毒血癥甚至死亡；單獨利用在ASFV 附著中發(fā)揮重要作用的p54 蛋白研制ASFV亞單位疫苗，也遇到與p30 類似的問題，免疫保護率基本為0[15]。相關(guān)試驗結(jié)果見表1。

4 DNA 疫苗

DNA 疫苗又被稱為核酸疫苗，是指將編碼ASFV 特異性蛋白質(zhì)抗原的重組真核表達載體直接注射到生豬體內(nèi)，使編碼后的ASFV 蛋白質(zhì)抗原基因能夠在生豬體內(nèi)表達并使生豬產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答，從而對生豬起到免疫保護作用。目前DNA 疫苗已經(jīng)被廣泛應(yīng)用到防控豬偽狂犬病、豬繁殖與呼吸綜合征、豬瘟等多種生豬病毒性疾病當(dāng)中，具有可消除疫苗毒性、能同時誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞免疫和體液免疫、保存制作更加適應(yīng)需求等特點，也被稱為第三代疫苗（前兩代疫苗按時間順序是滅活疫苗、減毒活疫苗）。但是在研制ASFV DNA 疫苗中，也同樣遇到不少問題和難點，比如使用p54/p30 作為靶抗原制作的DNA 疫苗在生豬體內(nèi)無法產(chǎn)生中和抗體，也不能誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞免疫[18]，p54/p30/sHA 融合制成的DNA 疫苗對生豬的保護效率幾乎為0[19]。

5 病毒載體疫苗

病毒載體疫苗是使用病毒載體誘導(dǎo)特異性免疫及非特異性免疫的疫苗，是通過去除或使用免疫原替換病毒毒力基因，或使病毒載體無法復(fù)制來保障疫苗安全性的一種手段。但是迄今為止，對研制ASFV 載體疫苗的相關(guān)文獻甚少，而且均缺少對ASFV 強毒株攻擊的免疫評價和動物性試驗，因而需要對其進行進一步探究和分析[5]。

6 結(jié)語

ASFV 疫苗研制至今已經(jīng)有長達幾十年的歷史，但是由于ASFV 具有比尋常病毒更加巨大的基因組、多達24 種的基因型、迅速的變異能力、復(fù)雜多變的免疫逃逸機制等特點，現(xiàn)在仍然沒有研制成功可以在生豬體內(nèi)能起到有效作用的疫苗。滅活疫苗相對安全，但是提供的保護力偏低；DNA疫苗還無法誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答；病毒載體疫苗需要精準(zhǔn)定位ASFV 免疫原基因；減毒活疫苗可以提供同源保護，是目前比較理想的ASFV疫苗研制途徑，但是存在較大的生物安全隱患。ASFV 疫苗的研制仍然需要加深對ASFV 致病機理的研究，準(zhǔn)確定位致病基因，努力探索ASFV 疫苗與宿主細(xì)胞的相互作用機理，同時要加強國內(nèi)外生物安全性級別高的實驗室的合作研究，只有這樣才能加快ASFV 疫苗研制成功的步伐。