碳納米管作為載體在生物醫學中的研究進展

楊 敏，張 瑜，朱效博，王 濤，宋翠平，楊智和，李木子，王桂琴，趙思俊

（1.寧夏大學，寧夏銀川 750021；2.中國動物衛生與流行病學中心，山東青島 266032；3.山西農業大學，山西晉中 030800；4.青島市智慧鄉村發展服務中心，山東青島 266200；5.天津農學院，天津 300384）

細胞對蛋白質和核酸等外來物質滲透性較差，使這些生物分子不易穿越細胞膜進入細胞。因此有必要尋求可在細胞內運輸生物分子（如DNA、蛋白質、藥物等）的新型載體，以便有效突破細胞膜屏障，運送和使用細胞外的藥物并使其發揮功能[1-3]。目前諸多藥物載體的出現降低或避免了藥物在單獨使用過程中存在的組織分布差、溶解率低、選擇性缺乏等不足[4-5]。隨著人們對納米技術的深入探索，各種納米材料已被廣泛應用于生物醫學領域中。其中，具有特殊性能的碳納米管（carbon nanotubes，CNTs）能有效跨越生物屏障，穿透多種細胞[6-7]。與傳統藥物載體相比，CNTs 具有體積小、比表面積高、可功能化、細胞穿透能力強，以及可與更多的生物大分子和藥物結合的特點，成為一類新型載體，使其在蛋白質、基因和藥物的傳遞方面具有廣闊的應用前景[8-9]。

1 CNTs 的分類

CNTs 可分為單壁碳納米管（single-walled carbon nanotubes，SWCNTs）和多壁碳納米管（multi-walled carbon nanotubes，MWCNTs）[10]。SWCNTs 由單個石墨烯組成，直徑通常為0.4～3.0 nm，長度通常為20～1 000 nm；MWCNTs 由多層石墨烯組成，直徑通常為1.4～100.0 nm，長度通常為1～50 μm。CNTs 的每個碳原子以sp2鍵結合，比金剛石中的sp3鍵更強，使得CNTs 具有獨特的物理化學性質，如表面易修飾、能進入細胞、生物相容性好、非免疫原性等[11-12]。

2 CNTs 進入細胞的方式

通常認為CNTs 進入細胞有內吞作用和被動擴散兩種方式。內吞作用是細胞膜依靠能量吞噬細胞外物質，可進一步分為胞飲作用、吞噬作用和網格蛋白介導作用[13-14]；被動擴散是CNTs 直接滲透到細胞質，通常是指CNTs 與脂膜的親脂作用，從而發生內化[15]。Zhu 等[16]將釀酒酵母細胞加入到4 ℃條件下氧化的SWCNTs 懸液中，使用拉曼分光光度計定量測定釀酒酵母中氧化的SWCNTs，并用實時聚合酶鏈反應（real-time PCR）檢測細胞內吞的相關基因，結果發現氧化的SWCNTs 可通過內吞作用進入釀酒酵母細胞，并分布到細胞質、囊泡、溶酶體和細胞核中。Porter 等[17]將細胞與SWCNTs 溶液混合2 d 后發現，大多數SWCNTs位于細胞的吞噬小體和溶酶體內，體現了SWCNTs的吞噬作用；第4 天，可觀察到SWCNTs 通過細胞膜轉移到鄰近的細胞質中，表明此過程是脂質雙分子層的被動攝取。因此，SWCNTs 進入細胞可能同時存在內吞作用和被動擴散兩種方式。Dumortier 等[18]通過氧化/酰胺化處理和1,3-偶極環加成反應制備了兩種類型功能化CNTs，研究發現經過功能化的CNTs 在體外均可被B 淋巴細胞、T 淋巴細胞以及巨噬細胞攝取，并且通過氧化/酰胺化處理的CNTs 可形成穩定的水懸浮液。

3 CNTs 的功能化

CNTs 難溶于多數溶劑，且因π-π 共軛、疏水力、范德華力等作用，分散性較弱，極易在溶液中形成團聚現象。CNTs 的特殊性能可被各種化學物質功能化和修飾[19]。功能化使CNTs 表面性質發生了改變，增加了其分散性、均勻性和溶解性。因此，CNTs 的功能化使其在生物醫學中的應用更加廣泛，通過在CNTs 的側壁和末端引入不同基團，可將多肽、蛋白質、核酸以及藥物等生物分子通過共價或非共價作用偶聯到CNTs 上[20]，從而可以靶向病灶部位的組織、器官，達到治療疾病的目的[21]。根據功能化的分類可分為共價功能化和非共價功能化。

3.1 共價功能化

共價功能化通過改變CNTs 的結構，使碳雜化從sp2變為sp3，從而改變CNTs 的特性，使CNTs具備負載藥物及生物分子的能力。共價功能化最常見的方法是通過強酸氧化處理CNTs，在其表面生成羧基基團。盡管共價功能化破壞了CNTs 的π-π共軛，但其氧化為氨、凝集素和氨基酸等進一步修飾提供了機會[22]。CNTs 表面的羧基在與亞硫酰氯反應之后，對加入含有游離氨基團的化合物進行修飾[23]；通過共價修飾，可以制備不同烷基鏈或末端官能團，生成不同的CNTs 復合物，從而增強CNTs 的生物相容性和靶向附著生物分子的潛力及其在生物醫學中的應用[24]。

3.2 非共價功能化

CNTs 的非共價功能化是基于π-π 共軛、氫鍵、靜電、范德華力和疏水作用等不同的作用方式[25]，通過表面活性劑、芳香族化合物、聚合物等進行非共價功能化。此方法不會對CNTs 的獨特結構造成破壞，并保留了CNTs 的物理、光學、熱和電性能等原有性質[26]，同時也保留了CNTs 的sp2雜化六元環和擴展偶聯。

4 CNTs 作為載體的應用

CNTs 特殊的性能和獨特的結構，可共價鍵合不同種類的化學基團，也可非共價偶聯多種生物大分子。同時，CNTs 具有良好的細胞穿透性，作為載體時，在增加藥物負載率、提高藥物療效方面顯示出潛在的應用價值[27]。

4.1 CNTs 作為蛋白質載體

Zhao 等[28]研究比較了3 種不同直徑MWCNTs 吸附牛血清蛋白的特征，發現直徑小于10 nm 的MWCNTs 相比直徑為10～20 nm 和20～40 nm的能吸附更多牛血清蛋白。周霜[29]發現：CNTs可與肌紅蛋白發生較強的作用，通過改變肌紅蛋白的二級結構，使其主肽鏈發生去折疊或者重排；血液中的蛋白質也可通過非共價相互作用與CNTs結合形成蛋白質冠，從而影響CNTs 和血液的生物相容性。Lu 等[30]研究了3 種長度為1～3 μm，直徑為1～2 nm，含不同官能團的CNTs 對人血清白蛋白的吸附作用，發現羧基化SWCNTs 對人血清白蛋白的吸附率遠高于羥基化SWCNTs 和氨基化SWCNTs 對人血清白蛋白的吸附率。隨后，Lu 等[31]又比較了人免疫球蛋白G、人血清白蛋白和纖維蛋白原與長度為1～3 μm，直徑為1～2 nm的SWCNTs 的結合能力，結果發現纖維蛋白原與SWCNTs 的吸附量最高，且僅用人免疫球蛋白G與SWCNTs 結合就會刺激中性粒細胞中髓過氧化物酶的釋放。Nicoletti 等[32]研究表明：羧基或氨基功能化的MWCNTs 可以與免疫球蛋白等高豐度蛋白以及載脂蛋白、補體成分等低豐度蛋白形成蛋白冠；經聚乙二醇功能化的MWCNTs 也可與人血漿蛋白形成蛋白冠[33]。以上研究均表明，CNTs 可與蛋白質發生作用。

4.2 CNTs 作為基因載體

基因傳遞到細胞的方法可分為兩種：病毒基因載體和非病毒基因載體。病毒基因載體是病毒攜帶基因進入細胞，此法可高效遞送基因，使基因高水平表達，但是會造成機體產生炎癥反應和免疫原性；非病毒基因載體是通過物理和化學方法使目的基因進入細胞[15]。Nahle 等[34]將NR8383 大鼠肺泡巨噬細胞作為體外模型研究后發現：經氨基或羧基功能化的MWCNTs 可改變哺乳動物雷帕霉素靶蛋白信號通路，從而增加Lamtor（晚期溶酶體和核內體接頭蛋白）編碼基因的表達；此外，氨基功能化的MWCNTs可激活轉錄因子EB并誘導自噬，羧基功能化的MWCNTs 可改變真核翻譯起始因子4 和磷酸蛋白70 核糖體蛋白S6 激酶信號通路，并上調Toll 樣受體2 基因的表達。Edwards 等[35]研究發現，經聚酰胺-胺型樹枝狀功能化的CNTs 能有效傳遞雙鏈核糖核酸（double stranded RNA，dsRNA）、聚酰胺-胺型樹枝狀-CNTs-dsRNA復合物，使其快速進入靶細胞，并誘導產生比單獨使用dsRNA 更強的效果。Munk[36]等將羧基化MWCNTs 與質粒DNA 以5:1（質量比）的比例混合，渦動孵育形成羧基化MWCNTs-質粒DNA 復合物，然后將含綠色熒光蛋白基因的質粒DNA 導入成纖維細胞，利用流式細胞儀、熒光成像和realtime PCR 分析，證明羧基化MWCNTs 可將質粒DNA 傳遞到牛原代成纖維細胞。開放閱讀框149（open reading frame149，ORF149）基因是編碼錦鯉皰疹病毒（koi herpes virus，KHV）的主要免疫原性蛋白之一。Hu 等[37]構建了重組質粒pcDNAORF149，制備了SWCNTs-pcDNA-ORF149 復合物，用于制作KHV 疫苗，結果發現相同劑量下，注射SWCNT-pcDNA-ORF149 疫苗的抗體含量遠高于只注射pcDNA-ORF149 的抗體含量，免疫效果提高了33.9%。SWCNTs-pcDNA-ORF149 疫苗不但可誘導錦鯉產生血清抗體，而且還提高了酶活性和免疫相關基因表達水平，并提出肌肉注射10 μg SWCNTs-pcDNA-ORF149 對錦鯉抵抗KHV 的免疫效果最佳。Munk 等[38]將MWCNTs 與質粒DNA偶聯，形成MWCNTs-質粒DNA 復合物，用于體外受精牛胚胎的轉染，發現MWCNTs-質粒DNA可穿過透明帶，進入胚胎中，且不會改變胚胎中的基因水平表達。以上研究均表明，CNTs可作為載體，提高基因的表達水平。

4.3 CNTs 作為抗癌藥物載體

CNTs 比表面積高，可以很容易結合各種藥物進行藥物傳遞，達到理想的治療效果。Salastrevi?o 等[39]設計了一種透明質酸與氧化MWCNTs的復合物作為載體，結合藥物卡鉑用于體外模型肺癌的治療，初步研究表明氧化MWCNTs-透明質酸-卡鉑復合物具有良好的體外特異性抗癌作用。Jawahar 等[40]將純化的CNTs 與聚乙二醇、葉酸溶液一起超聲，形成葉酸-聚乙二醇-CNTs的復合物，然后將鹽酸雷洛昔芬通過疏水作用與葉酸-聚乙二醇-CNTs 結合，結果發現葉酸-聚乙二醇-CNTs有助于提高鹽酸雷洛昔芬的載藥率，載藥率為74.2%±4.67%，因而可提高乳腺癌的治療療效，還能作為活性靶向配體靶向癌細胞。Li 等[41]制備了一種CNTs（Fe）/羥基磷灰石的復合物，再用殼聚糖和葉酸對所合成的CNTs（Fe）/羥基磷灰石復合物進行化學修飾，制備了一種新型磁性靶向藥物載體，發現葉酸-殼聚糖-CNTs（Fe）/羥基磷灰石復合物對多西環素的平均載藥率可達130%，并且鐵磁性可以使載體在磁場下傳遞藥物，從而實現藥物的靶向作用。Jagusiak 等[42]制備了SWCNTs 與剛果紅的復合物，然后將多西環素偶聯到SWCNTs-剛果紅的復合物上，結果發現SWCNTs-剛果紅大大增加了多西環素的載藥率，與藥物結合的高能力可能會降低體內藥物載體復合物的排泄率，延長藥物在靶位點的作用時間。Tavakolifard 等[43]用紫杉醇、葉酸對SWCNTs 進行功能化，形成了紫杉醇-葉酸-SWCNTs 的復合物，通過傅里葉紅外光譜、紫外可見吸收光譜等方法檢測都證明葉酸和紫杉醇已成功加載到SWCNTs 上。Rathod 等[44]通過使用乙二胺和苯基硼酸基團對CNTs 表面進行雙官能團化，形成了乙二胺-苯基硼酸-CNTs 的復合物，然后在功能化后的CNTs 上加入紫杉醇，結果發現紫杉醇通過π-π 相互作用偶聯到CNTs 上，且載藥率可高達30.85%。Comparetti 等[45]也研究發現，CNTs 是紫杉醇治療癌細胞的有效載體，并將抗前列腺特異性膜抗原的抗體和負載紫杉醇的CNTs 分別作用于前列腺癌細胞和結腸癌細胞，結果發現抗前列腺特異性膜抗原的抗體可增強CNTs-紫杉醇藥物的療效和對前列腺癌細胞的殺傷作用，但對結腸癌細胞的殺傷效果不明顯，展示了該方法的特異性。以上研究均表明，CNTs 可作為載體，增加藥物的載藥率并提高藥物療效。

5 小結和展望

本文綜述了CNTs 功能化的方法和其穿透細胞的優異能力，及其作為載體在蛋白質、基因和抗癌藥物等方面的研究進展。近年來，越來越多的研究團隊探索了將生物分子偶聯到CNTs 的各種方法，在這過程中，如果能更好地通過功能化提高CNTs在溶液中的分散性、穩定性，增強組織相容性，以最大限度地提高其與生物分子的偶聯率和活性，這將進一步實現CNTs 的有效利用。