乳酸菌抗菌肽的純化過程及其影響因素

◎ 劉 輝，張會生，童火艷，江曉楠，陳曉婷

（1.廣東海天創新技術有限公司，廣東 佛山 528000；2.佛山市國創生物發酵食品技術創新中心，廣東 佛山 528000）

在細菌的代謝產物中，抗菌肽又被稱為細菌素，既可以由革蘭氏陽性細菌產生，也可以由革蘭氏陰性細菌產生[1]。在革蘭氏陽性細菌中，乳酸菌是一類產抗菌肽種類特別豐富的微生物[2]。近年來，乳酸菌抗菌肽在食品工業和醫藥方面潛在的應用前景，使得乳酸菌抗菌肽備受關注。很多抗菌肽都已被證明無論是在體外還是在體內，都可以有效抑制食源性致病菌和腐敗菌[3]。乳酸菌抗菌肽作為一種天然防腐劑，已廣泛應用在食品保藏中。乳酸菌抗菌肽的應用主要有2種途徑。①直接加入產抗菌肽的乳酸菌。②直接加入制備出的抗菌肽（來源于純化發酵上清液或人工合成）。

乳酸菌抗菌肽的廣泛應用也極大地促進了檢測、定量、純化等下游過程的技術開發[4]。到目前為止，只有乳酸鏈球菌肽（Nisin ）被允許在食品中應用。然而，Nisin只能殺死或抑制革蘭氏陽性細菌，且抗菌譜較窄。目前阻礙抗菌肽產業化的主要因素有2點。①缺乏能彌補Nisin缺陷的典型廣譜抗菌肽。②乳酸菌抗菌肽產量低，純化工藝煩瑣、成本過高。基于此，本文主要對抗菌肽的純化過程以及其中存在的問題進行了綜述，為抗菌肽的規模純化提供理論依據。

1 乳酸菌抗菌肽的主要類別及純化方法

乳酸菌抗菌肽根據其結構和功能特性可分為4大類。①羊毛硫脂素類，主要特點是在其內部有修飾基團[5]。②無修飾抗菌肽，其主要特點是沒有修飾基團，此類抗菌肽因結構特點可分為4種亞類，包括ClassⅠⅠa、Class ⅠⅠb、Class ⅠⅠc 和 Class ⅠⅠd[6]。③大分子熱敏感抗菌肽[7]。④一種被糖基化或脂類修飾的抗菌肽[8]。前2類抗菌肽是目前研究的熱點，也是本文綜述的重點。

抗菌肽在分類上有所不同，但是其結構特點大體相同，都是由少量氨基組成的小肽，都含有陽離子、具有疏水性等。因此抗菌肽的純化方法不盡相同，如利用鹽析從發酵上清液中將抗菌肽沉淀出來或者酸提法，還有離子交換層析法、疏水層析法及凝膠過濾或反相色譜法。

2 乳酸菌抗菌肽的初分離

2.1.1 鹽析法和有機溶劑法提取抗菌肽

乳酸菌抗菌肽是乳酸菌發酵后分泌的一種具有抑菌作用的小肽。為了研究其性質和結構，就需要從發酵上清液濃縮抗菌肽。鹽析法是最為常用的方法，鹽析法一般選用的試劑是硫酸銨，依據不同的飽和度將抗菌肽沉淀出來，抗菌肽的高鹽穩定性使得硫酸銨飽和度達到80%也不會干擾其抗菌活性[9]。然而，鹽析法操作煩瑣、時間長、回收率低。因此，有研究人員根據抗菌肽在機溶液中具有一定的溶解性和穩定性（如丙酮、乙醇、氯仿），采用有機溶劑萃取法提取抗菌肽，結果證明可以有效提取抗菌肽[10]。有機溶劑萃取法也有一定缺點。①抗菌肽不一定存在于有機溶液中，而是主要存在于水相和有機相之間[11]。②并不是任何一種有機溶液都可以提取乳酸菌抗菌肽，有機溶液可以使某些抗菌肽失活[12]。

2.1.2 吸附解析法

由于硫酸銨沉淀和有機溶液的方法存在缺陷，YANG等人[13]研究出一種吸附-解析法，可以有效提取抗菌肽。這個方法主要是調整帶有乳酸菌的發酵液pH值為5.0～7.0，使抗菌肽吸附在乳酸菌上，離心后得到菌體，用5%磷酸將抗菌肽從乳酸菌表面解析下來，可以有效濃縮抗菌肽。WAYAH等人[14]利用酸提取（pH為2.0）后，通過反相高效液相色譜法（Reversed-Phase High Performance Liquid Chromatography，RP-HPLC）RP-HPLC提取出高純度的抗菌肽。根據YANG等人[13]的提取原理，又出現了很多有效的提取方法，如COVENTRY等人[15]利用Micro-Cel（一種食品級的硅藻土硅酸防結塊劑）將抗菌肽吸附在上面，然后用1%脫氧膽酸鹽溶液和1%SDS解析下來。JANES等人[16]研究出另外一種吸附解析方法，是將抗菌肽吸附在稻殼灰或硅酸上，在pH為2.5或3.0的酸性條件下90 ℃加熱5 min進行解析。這種方法并不適用于每一種抗菌肽，有很多抗菌肽無法用吸附-解析法提取[17]，具有一定的限制性。

2.1.3 樹脂法

一些羊毛硫脂素抗菌肽可以通過樹脂吸附方法從發酵上清液中得到濃縮，常用樹脂有Amberlite XAD-16、XAD-2、Serdolit PAD-Ⅰ[18-20]。這種方法可以減少發酵中的污染，但是樹脂法并不適用于所有抗菌肽的提取，利用樹脂提取雙肽鏈抗菌肽，其提取率非常低，且樹脂法無法大批量純化抗菌肽[21]。

2.2 乳酸菌抗菌肽的精分離

2.2.1 傳統精分離方法

乳酸菌抗菌肽的濃縮只是為了減少工作液的體積，并不能提高抗菌肽的純度，因此需要應用一系列的色譜柱。可以利用抗菌肽含有陽離子以及疏水的特性使用不同類型的色譜柱。目前，陽離子交換色譜柱（SP-Sepharose或CM-Sepharose）最為常用，利用NaCl線性梯度洗脫可以分離抗菌肽，之后還可以利用疏水色譜柱（Phenyl-Sepharose或Octyl-Sepharose）進一步純化，最后將有活性的部分收集起來，并通過RP-HPLC或者快速蛋白液相色譜（Fast Protein Liquid Chromatography，FPLC）分離出高純度的抗菌肽[22]。RP-HPLC是抗菌肽分離純化的最后一步，雖然可以得到高純度的抗菌肽，但是上樣量低、產量少、損失大，不利于大規模提取抗菌肽。為了解決這一系列問題，提高回收率，CALLEWAERT等人[23]利用強陽離子柱，直接用發酵液上柱，但是沒有得到很好的收回率。CALLEWAERT等人[23]又研究出了3步提純的新方法：硫酸銨沉淀、用甲醇/氯仿提取、用RP-HPLC純化。GUYONNET等人[24]報道的純化方法，將培養基滅菌溫度改為110 ℃，時間為12 min，以此減少培養基的顏色變化，用陽離子柱（Cellufine C-200）代替硫酸銨沉淀，并利用SEP C18，回收率最高可達60%，純度在95%以上。UTENG等人[25]縮短了純化步驟，形成二步分離法。第一步直接將菌體發酵液過陽離子交換柱（SP-Sepharose Fast Flow），用1 mol·L-1NaCl洗脫，第二步用反相快速蛋白色譜柱（Reversed-Phase Fast Protein Liquid Chromatography，RP-FPLC）進一步純化，回收率達到90%以上。

2.2.2 免疫親和純化

免疫親和純化與上面提到的純化方法原理不同，利用抗原與抗體結合相對專一的特點分離純化抗菌肽，通過一步純化就可以得到較高純度的抗菌肽，研發人員采用Nisin A的單克隆抗體與HiTrap N-hydroxysuccinimide偶合，成功純化出Nisin A[26]。除Nisin 外，已有很多單克隆抗體用于純化抗菌肽，如Enterocin B、Nisin Z、Pediocin PA-1等。雖然很多乳酸菌抗菌肽的特異性抗體己經被報道，但是單克隆或多克隆抗體親和層析柱主要還是應用于檢測和定量，而不是應用在純化抗菌肽方面。

2.2.3 其他分離純化方法

DUTRA等人[27]提出簡單而又快捷的提取方法，稱為液體兩相微細胞系統（Aqueous Two-Phase Micellar Systems，ATPMS）。這種方法可以直接從發酵液提取出純度很高的生物分子并且滿足工業化生產的要求。此外，研究人員廣泛采用雙水相系統法（Aqueous Two-Phase Systems，ATPS）提取乳酸菌抗菌肽。此方法主要試劑是聚乙二醇/葡聚糖、聚乙二醇/磷酸鹽[28]。這種提取方法可以從復雜的培養基中大規模的提取生物分子，成本低，時間短。未來可能會成為大規模分離純化抗菌肽的新方法。

3 影響乳酸菌抗菌肽純化的因素

3.1 乳酸菌培養基類型對乳酸菌抗菌肽純化的影響

乳酸菌是一種對營養要求很高的微生物，培養乳酸菌多數選擇MRS、M17或GM17、Ellikert、APT等營養豐富的培養基[29]。這些培養基雖然有利于乳酸菌生長代謝合成抗菌肽，但同時也干擾了抗菌肽的分離純化。BAREFOOT等人[30]研究表明，這些在MRS中的小分子肽雖然有利于抗菌肽Lactacin B的產生，卻干擾了純化過程。HASTⅠNGS等人[31]研究表明，半合成培養基比MRS培養基能減少培養基中的雜質對分離純化過程的干擾。RAMMELSBERG等人[32]研究表明，復雜的培養基不適合純化抗菌肽Caseicin 80，主要是受到一種未知的大分子物質影響。雖然復雜的培養基不利于分離純化，但可以提高抗菌肽的產量，以滿足分離純化的要求。YANG等人[33]對比了Nisin、pediocin AcH，leuconocin Lcm1 和sakacin A在TGE培養中產量，發現pediocin AcH在無緩沖液的TGE培養基產量更好，而其他3種則在有緩沖液的TGE培養基產量更高。由此可知，為更好地分離純化抗菌肽，需要對培養基進行優化或者篩選更為適合的培養基，從而去除干擾成分和雜質對抗菌肽純化帶來的影響。

3.2 培養基成分對乳酸菌抗菌肽純化的影響

培養基中的成分不僅可以影響抗菌肽的產量，而且也會影響抗菌肽的分離純化過程。MURⅠANA等人[34]發現，用硫酸銨沉淀含有Tween 80的發酵上清液，離心后的溶液為3層，包括表面薄層、底層沉淀、中間澄清層。抗菌肽Lactocin S離心后表面薄層中存在部分抗菌肽，而且在飽和度40%的硫酸銨沉淀Lactocin F時，有97%的抗菌活性在表面薄層中，只有3%在離心后的沉淀中。VAN LAACK等人[35]研究表明，在沒有Tween 80的MRS培養基中培養乳酸菌，不僅影響乳酸菌的生長，而且抗菌肽的產量也會降低。KAWAⅠ等人[36]研究表明無Tween 80無法產生抗菌肽，用油酸代替Tween 80，結果抗菌肽gassericin A的活力提高了4 500倍。SAAVEDRA等人[20]通過調整滅菌溫度，減少培養基顏色對分離純化的污染。JⅠMENEZ等人[37]研究表明在MRS培養基中加入4%NaCl能提高抗菌肽的活性，同時還發現了另外一種抗菌肽plantaricin T。RAMMELSBERG等人[32]研究表明在SM-2培養基中加入蛋白胨，抗菌肽caseicin 80的產量提高2～3倍。DABA等人[38]研究表明在不同培養基中（MRS、Elliker、乳清）加入酵母提取物可以顯著提高抗菌肽mesenteroides UL5的產量。但是蛋白胨和酵母提取物中含有大量的小分子肽類，加大了抗菌肽的分離純化的難度。因此，最有效的減少培養基成分對抗菌肽分離純化影響的方法就是預先對產抗菌肽的培養基進行優化。

3.3 分離純化技術對乳酸菌抗菌肽的影響

在分離純化乳酸菌抗菌肽的過程中，抗菌肽活性是評價抗菌肽分離純化效果的關鍵指標。導致活性降低的因素主要有3類。①分離技術的選擇，如超濾，疏水柱使用都會降低抗菌肽的活性，如在純化caseicin 80過程中超濾損失大量caseicin 80，與之相反的是lactacin F經過超濾后其活性提高14倍[39]。②樣品處理過程，如透析或凍干等，都可能造成活性大量損失[31,40]。③pH值的變化，在純化過程中pH變化過大，也會導致抗菌肽活性下降，一般在酸性條件下有好的分離純化效果。因此在抗菌肽的分離純化過程中，盡量保持在酸性pH下，同時盡量減少不必要的樣品處理工藝。選擇適合的分離純化工藝十分重要。

3.4 影響乳酸菌抗菌肽活力測定的因素

在乳酸菌抗菌肽分離純化過程中，乳酸菌抗菌肽的活力測定、肽含量測定以及純化倍數等都是十分重要的指標。在活力測定中最為常用的是以瓊脂擴散為主要原理的牛津杯法和點種法。TAGG等人[41]指出，抗菌肽活性分析要結合測試條件和指示菌的靈敏性，同時指示菌的密度也是測定效價和選擇方法的關鍵。測定蛋白濃度有很多方法，如Folin-Lowry法、Biuret法、Bradford法和BCA法，也有方法是直接用分光光度計在220 nm測定吸光度值。目前最為常用的是BCA法，其靈敏度高、穩定、干擾因素少。Tricine-SDS-PAGE是一種十分有效的方法，能判斷測定半純化或純化后的抑菌物質為肽類或者是蛋白類，但是小分子疏水性抗菌肽類不適合用Tricine-SDS-PAGE電泳方法，因為小分子疏水性抗菌肽會彌散，從而無法通過染色看到肽類條帶[42]。為了克服這一個問題，BHUNⅠA等人[43]研究出一種電泳法，將膠放在含指示菌的半固體培養基上，培養后形成可見的抑菌圈，根據預染Markers確定抗菌肽分子量范圍。此外，SYPRO-Ruby新型染料的發明也彌補了抗菌肽無法染色的缺點，為抗菌肽的質譜和測序提供了可能。

3.5 影響乳酸菌抗菌肽的穩定性的因素

目前，很多文獻報道純化后的抗菌肽穩定性會變弱。如純化后的抗菌肽mesentericin Y105和leucocin A-UAL187性質不穩定。PAULA等人[44]分析表明抗菌肽在低pH值環境中保存比高pH值更為穩定。在中性或高pH值中，抗菌肽容易被蛋白酶水解失活或者自身聚合。溫度也是影響因素之一，DAVY等人[45]研究表明，純化后抗菌肽在4 ℃或室溫條件下一周就完全失活。ABRⅠOUEL等人[46]研究表明，AS-48在發生聚合后依然具有抗菌肽活性。此外，溫度、pH、金屬離子、蛋白酶、反復凍融和化學試劑都會對抗菌肽活性產生影響。

加入穩定劑有助于保護抗菌肽的活性，防止肽類聚合。常用的保護劑有以下幾種。①糖類/多元醇，如蔗糖、海藻糖、甘露醇及葡萄糖。②聚合物，如HES、PVP、PEG、葡聚糖及清蛋白等。③無水溶劑，如乙烯乙二醇、甘油、DMSO及DMF等。④表面活性劑，如Tween 80等。⑤氨基酸，如蘇氨酸、谷氨酸鈉、甘氨酸、谷氨酸及肌氨酸等。⑥鹽類，如磷酸鹽、醋酸鹽及檸檬酸鹽等[47-49]。

4 結語

乳酸菌抗菌肽的分離純化經歷幾十年的發展已經進入重要的階段，目前乳酸菌抗菌肽的回收率依然面臨3個重要問題。分離過程需要大幅縮短時間和簡化工藝，減少乳酸菌抗菌肽的損失。乳酸菌抗菌肽回收率低，達不到工業化生產的要求。分離純化抗菌肽的過程大量使用有機溶劑會引發環境污染問題仍需考慮。但隨著乳酸菌分離純化工藝的進步，更多乳酸菌抗菌肽提取方法被研發與應用，將會有更多乳酸菌抗菌肽被大規模工業化生產，應用于食品領域。