鴨胚胎發育過程中腸道菌群的演替規律研究

孫玲利，劉一思，浦發軍，郝振芳，寧俊平，楊小杰

（1.河南農業職業學院，河南鄭州 451450；2.四川農業大學動物科技學院，四川雅安 625014；3.汝州市畜牧局，河南汝州 467599）

腸道微生物在機體中的數量是體細胞數量的數倍，其在維持穩態、調節宿主免疫系統、影響宿主生長發育過程中發揮了積極作用（Wen 等，2019）。同時，腸道微生物群也是重要的內分泌器官，可通過多種途徑參與調控宿主能量、血糖和炎癥，且部分腸道核心菌群能夠參與宿主必需氨基酸、能量、輔因子和維生素等營養物質代謝（Rastelli 等，2019）。由此可見，腸道微生物與畜禽生長發育和生產性能密切相關。

胚胎期早期定植的最初微生物菌群會影響新陳代謝、胃腸道發育與成熟、免疫系統功能等，對畜禽腸道發育及相關器官的發育和健康具有重要意義。作為水禽，鴨具有在胚胎發育中期開始由小腸吸收卵黃的特點，卵黃是鴨胚胎發育的重要營養來源，因此，胚胎時期的腸道發育及腸道功能對禽類具有重要意義。本研究通過對不同胚齡鴨盲腸進行組織學觀察，并對胚胎發育不同時期的鴨胚胎的整個腸道進行16s rRNA 測序，探究隨著鴨胚胎發育，腸道菌群結構組成及演替規律，旨在為禽類胚胎期的腸道微生物定植研究提供參考，也為微生態制劑在畜牧業生產上的合理開發與應用奠定理論基礎。

1 材料和方法

1.1 樣品采集 試驗選用來自于20月齡農華麻鴨的種蛋，置于孵化機（倍立孵全自動孵化機440型）中孵化，孵化溫度為37.2～37.8℃，濕度為55%～65%。種蛋在孵化器中的位置隨機分布，且種蛋重量平均為78.3 g，無顯著差異。在無菌條件下收集18 份樣品，包括孵化至第16（E16）、22 天（E22）的胚胎和出殼第一天（D1）的雛鴨的整個腸道，每個階段6 個樣品，用于腸道微生物的測定。將采集的樣品裝入EP 管中，立即在-80℃保存。采集孵化至E16、E22 的胚胎和出殼第一天的雛鴨的盲腸樣品保存在2%多聚甲醛溶液中，用于制作組織學切片觀察。剛孵出的雛鴨被養在無菌室里。胚胎標本采集、微生物基因組DNA 提取、PCR 擴增均采用無菌操作。

1.2 盲腸切片制作及組織學觀察 對盲腸進行切片，以觀察隨卵黃吸收腸道絨毛變化情況。樣品用2% 多聚甲醛溶液固定后，用全自動密閉式組織脫水機（Leica TP1020）進行梯度乙醇脫水、二甲苯透明、浸蠟。脫水后的組織用石蠟包埋，切片厚度4μm，經脫蠟后用HE 染色試劑盒（Solarbio）進行HE 染色，經梯度乙醇脫水、二甲苯透明后，用中性樹脂封片。用OLYMPUS BX53電子顯微鏡在低倍鏡下觀測切片，選擇典型視野，在高倍鏡下觀測視野中所有的完整絨毛，拍照。

1.3 DNA 提取及16S rRNA 測序 通過將16、22 胚齡和出殼第一天鴨胚胎的整個腸道勻漿后，采用常用的SDS 方法提取樣本基因組，并采用瓊脂糖凝膠電泳的方式檢測提取基因組的純度和濃度。同時，將提取樣本基因組使用無菌水進行稀釋，使樣品DNA 的濃度稀釋至1 ng/μL。以稀釋濃度為1 ng/μL 樣品基因組DNA 為模板，擴增所有微生物16Sr RNA 序列，進行PCR 擴增產物的克隆與篩選，構建16Sr RNA 基因文庫，對16Sr RNA 的V3～V4 高變區進行測序和數據分析。樣本基因組的建庫、測序工作交由北京諾禾致源科技股份有限公司完成。

1.4 數據統計分析 利用Uparse 軟件（Uparse v7.0.1001）對所有樣品的全部待分析數據（Clean Reads）進行聚類，默認以97% 的一致性將序列聚類成為操作分類單位（OTUs），使用R 軟件（Version 2.15.3）繪制稀釋曲線，并使用R 軟件的vegan 包進行MRPP 分析檢驗腸道菌群結構差異。LEfSe 分析使用LEfSe 軟件，設置LDA Score 的篩選值為2。

2 結果

2.1 鴨胚胎發育過程中腸道形態觀察 由圖1可知，隨著胚胎的發育，腸腔體積不斷增加，腸絨毛數量增加，腸絨毛高度和肌層厚度變化不大。

2.2 鴨胚胎發育過程中腸道微生物群落結構分析 根據測序繪制OTUs 數量的稀疏曲線，評價測序量是否足以覆蓋所有物種，由表1可知，隨著樣本數量的增加，曲線趨于平緩，表明測序已達到飽和，測序數量足以反映腸道菌群的物種多樣性。MRPP 結果顯示，E16 組與D1 組間微生物群落結構差異顯著（P＜0.05），E16 組與E22 組、E22組與D1 組間微生物群落結構差異不顯著（P＞0.05）。

表1 MRPP 組間差異分析

2.3 鴨胚胎發育過程中腸道微生物的差異比較 韋恩圖顯示胚胎期與出殼后有45 個共有的微生物屬（圖2A），在胚胎期有沙雷氏菌（Serratia）、霍爾德曼氏菌、另枝菌、小桿菌、毛螺菌等62 個特有的微生物屬，出殼后有21 個特有的微生物屬，但含量均較少。由Lefse 分析可知（圖2B.C），擬桿菌門是胚胎期的標志門，包括科水平上的Muribaculaceae、鞘脂桿菌科以及屬水平上的日大生科菌屬。厚壁菌門是出殼后的標志門，包括屬水平上的羅姆布茨菌。在胚胎期，腸道微生物主要富集了乳酸桿菌、布勞特氏菌、糞桿菌、擬桿菌、無色桿菌5 種菌屬；在出殼后，腸道微生物主要富集了羅姆布茨菌、中慢生根瘤菌、藤黃色單胞菌3 種菌屬。

3 討論

近年來，關于哺乳動物與禽類腸道微生物的功能和多樣性研究取得了很大進展（Wang 等，2020；Zhu 等，2002）。大多數禽類腸道組織結構發育程度與養分吸收密切相關，在雞胚發育到18～19 d 時開始由小腸吸收卵黃，卵黃吸收與胚胎發育密切相關（Nangsuay 等，2011）。胚胎期的腸道發育有可能成為禽類終身健康的決定因素，而胚胎期腸道發育與微生物定植之間存在相互作用，腸道菌群可改善腸道發育（Dai 等，2020）。研究表明，在屬水平上，布勞特氏菌屬、羅氏菌屬的豐度與絨毛表面積呈顯著正相關（Dai 等，2021）。本研究發現，隨著鴨胚胎的發育，腸絨毛數量和腸腔容積逐漸增加，其有可能與胚胎腸道高豐度毛螺菌科及富集布勞特氏菌屬相關，進而促進胚胎腸道發育。

為了適應快速變化的發育環境，宿主不同發育階段的腸道微生物多樣性和豐度模式不同（Ding 等，2017）。本研究結果發現，在鴨胚胎期富集乳桿菌屬，其可促進胃腸道組織發育，并與飼料轉換率和增重密切相關（Beck 等，2019）。在鴨胚胎期富集毛螺菌科，其與飼料轉換率和增重密切相關（Gong 等，2007）。在雛鴨腸道中，羅姆布茨菌屬的豐度較高，可參與維持腸道內穩態，促進營養物質吸收（Million 等，2017；Zhu 等，2002）。以上研究結果表明，胚胎不同發育階段腸道微生物的組成和豐度存在差異，說明胚胎中早期定植的微生物菌群在后期發育中受環境及宿主自身遺傳的影響，并對腸道發育、營養吸收及宿主生長發育具有重要的調控作用。

4 結論

綜上所述，在鴨胚不同發育階段，鴨腸道已開始有微生物定植。在胚胎期，腸道微生物主要富集乳酸桿菌、布勞特氏菌、糞桿菌、擬桿菌、無色桿菌5 種菌屬，而出殼后，腸道微生物主要富集羅姆布茨菌、中慢生根瘤菌、藤黃色單胞菌3 種菌屬。說明隨著鴨胚胎發育及腸道發育，腸道微生物結構及豐度存在差異，本研究為禽類胚胎期的腸道微生物定植研究提供參考，也為微生態制劑在畜牧業生產上的合理開發與應用奠定理論基礎。