中藥補腎解毒方對輻射后孕鼠胎盤損傷的防護作用及氧化應激的影響

高 慶 李延暉 譚德慧 楊云霜

(1 中國人民解放軍火箭軍特色醫學中心中醫科，北京，100088； 2 北京市隆福醫院中醫科，北京，100010)

隨著近年科學技術的飛速發展，核能開始被廣泛應用于軍事、醫學以及人類的日常生活當中，其造福人類的作用顯而易見，但同時可能對人類產生一定的輻射損傷，有關輻射危害已然成為當下全球亟待解決的重大問題[1-2]。正常情況下，人類日常生活中基本上不會接觸大劑量的輻射，但是人類接觸中、低劑量輻射的概率較大[3]。生殖是人類繁衍生息的重要方式，隨著人類對輻射危害的認知日益深入，中、低劑量的輻射對人類生殖的影響開始受到廣泛的關注[4]。鑒于此，本文通過研究中藥補腎解毒方對輻射后孕鼠胎盤損傷的防護作用及對氧化應激的影響，為中藥補腎解毒方應用于輻射后孕鼠防護提供理論依據，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 選擇清潔級健康C57 BL/6 J雌性小鼠50只，體質量為(22±1)g；雄性小鼠25只，體質量為(25±2)g，均為12周齡。所有大鼠均購自北京鑫源順康科技有限公司，實驗動物許可證號：SCXK(京)2016-0008。放置于醫院動物飼養室飼養，無飲食、飲水的限制。本實驗經動物福利倫理委員會批準通過(倫理審批號：20200429)。

1.1.2 藥物 補腎解毒方(方藥組成：熟地黃10 g、山茱萸12 g、山藥10 g、牡丹皮10 g、茯苓10 g、澤瀉10 g、冬蟲夏草3 g、白花蛇舌草10 g)由北京康仁堂藥業有限公司中藥顆粒劑配制而成。

1.1.3 試劑與儀器 超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)(北京瑞格博科技發展有限公司，批號：019246)，谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione Peroxidase，GSH-Px)(北京瑞格博科技發展有限公司，批號：02065)，丙二醛(Malondialdehyde,MDA)試劑盒(北京瑞格博科技發展有限公司，批號：020635)，戊二醛(國藥集團化學試劑有限公司，批號：0198)，多聚甲醛固定液(國藥集團化學試劑有限公司，批號：0254)，磷酸緩沖鹽溶液(PBS)國藥集團化學試劑有限公司，批號：0366)，電子天平(賽多利斯科學儀器北京有限公司，型號：BSA224S)，輻射源為60Coγ-射線照射(北京伽瑪高新有限公司，型號：GM-11-03-A)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 1)分組：將所有受孕小鼠按照隨機數字表法分為空白對照組，低劑量輻射組，中劑量輻射組，低劑量輻射+補腎解毒方組，中劑量輻射+補腎解毒方組，每組10只。2)模型制備:將所有實驗小鼠進行為期3 d的適應性飼養之后，排除動情周期異常者，將雄鼠與處于動情前期的雌鼠按1∶2比例合籠交配，于次日清晨行雌鼠陰道涂片檢查精子，以發現陰栓和查到精子為受孕標志。

1.2.2 干預方法 低劑量輻射+補腎解毒方組和中劑量輻射+補腎解毒方組大鼠予以補腎解毒方灌胃干預，給藥劑量為13.5 g/(kg·d)。空白對照組，低劑量輻射組，中劑量輻射組則予以等體積的生理鹽水灌胃。各組連續灌胃10 d后，除空白對照組外，其余4組大鼠均予以γ射線照射，其中低劑量輻射與低劑量輻射+補腎解毒方組γ射線照射劑量為2 Gy，中劑量輻射組與中劑量輻射+補腎解毒方組γ射線照射劑量為4 Gy。孕鼠分娩時取胎盤，稱重后，一部分胎盤用生理鹽水漂洗，立即投入液氮中固定，于-80 ℃冰箱中保存，另一部分胎盤中性甲醛固定；仔鼠出生60 d，摘眼球取血，血液立即送檢；隨后斷頸處死，分別摘取卵巢、睪丸組織，稱重后，中性甲醛固定。

1.2.3 檢測指標與方法

1.2.3.1 胎盤指數計算 取出孕鼠子宮，剖開子宮后去除胎鼠胞衣，并將胎鼠和胎盤迅速剝離，逐一對應后稱重，胎盤指數=(胎盤質量/胎鼠質量)×100%。

1.2.3.2 氧化應激指標檢測 取部分稱量后的胎盤組織，采用磷酸鹽緩沖液(Phosphate-Buffered Saline,PBS)清洗，制作成質量分數為10%的組織勻漿，并遵循試劑盒說明書完成SOD、GSH-Px以及MDS的檢測。

2 結果

2.1 各組孕鼠妊娠結局比較 低劑量輻射組與中劑量輻射組孕鼠的活胎率明顯低于空白對照組；且死胎率高于空白對照組，而低劑量輻射+補腎解毒方組、中劑量輻射+補腎解毒方組孕鼠的活胎率明顯高于低劑量輻射組與中劑量輻射組，且死胎率低于死胎率低劑量輻射組與中劑量輻射組，各組比較差異均有統計學意義(均P<0.05)。見表1。

表1 各組孕鼠妊娠結局比較[只(%)]

2.2 各組仔鼠一般情況和胎盤指數比較 低劑量輻射組與中劑量輻射組仔鼠體質量、身長、尾長以及胎盤指數均明顯低于空白對照組，而低劑量輻射+補腎解毒方組，中劑量輻射+補腎解毒方組仔鼠體質量、身長、尾長以及胎盤指數均明顯高于低劑量輻射組與中劑量輻射組，各組比較差異均有統計學意義(均P<0.05)。見表2，圖1。

表2 各組仔鼠一般情況以及胎盤指數比較

圖1 各組光鏡下胎盤組織病理學情況(HE染色，×400)

2.3 各組孕鼠氧化應激指標水平比較 低劑量輻射組與中劑量輻射組孕鼠SOD、GSH-Px水平均低于空白對照組，而MDA水平高于空白對照組；低劑量輻射+補腎解毒方與中劑量輻射+補腎解毒方組孕鼠SOD、GSH-Px水平均高于空白對照組，而MDA水平低于空白對照組；各組比較差異均有統計學意義(均P<0.05)。見表3。

表3 各組孕鼠氧化應激指標水平比較

3 討論

既往，國內外針對輻射防護以及輻射防護藥物的研究主要集中在腫瘤治療、美容、農業以及原子能工業中，雖然越來越多的輻射防護藥物不斷被開發應用，但有關中藥復方進行輻射防護的研究并不多見[5-7]。隨著近年來人類對中醫藥的研究日益深入，具備標本同治、防治結合以及低毒高效特點的中藥受到了廣泛的關注，更是成功進入了從事輻射防護研究者的視野，然而有關專門針對生殖技能以及子代健康防治的中藥復方研究仍處于探索階段[8-10]。中醫認為，腎主生殖，乃藏精之所，于人體成長發育以及繁衍后代等多個方面起著至關重要的作用，和生殖系統關系密切，而電離輻射當屬火熱暴戾之邪，可直中臟腑，耗損肝腎之陰精，干擾生殖根本[11-14]。

本研究發現，輻射會在一定程度上降低孕鼠的活胎率，同時提高死胎率，且對仔鼠的體質量、身長、尾長以及胎盤指數均會產生明顯不利的影響。而采用中藥補腎解毒方干預之后，孕鼠的活胎率明顯提高，且仔鼠的體質量、身長、尾長以及胎盤指數均得到不同程度的改善。這與喬祚等[15]的研究結果一致：加中藥治療孕鼠的活胎率明顯高于僅用輻射治療，且仔鼠的體質量、身長、尾長以及胎盤指數均明顯高于僅用輻射治療。提示了中藥補腎解毒方可能具有輻射防護的作用，可明顯減輕輻射對孕鼠胎盤造成的損傷，同時降低輻射對仔鼠正常生長發育的影響程度。考慮原因可能在于：補腎解毒方主要是在六味地黃丸的基礎上化裁而來，且相應加入了冬蟲夏草以及白花蛇舌草，其中六味地黃丸可發揮調節大鼠下丘腦-垂體-卵巢軸的作用，繼而可促進卵巢功能的恢復以及改善，對女性生殖具有積極促進作用[16]。余雷等[17]的研究報道也說明了這一點。而冬蟲夏草味甘性溫，秘精益氣，專補命門；白花蛇舌草性寒苦，具有清熱解毒、瀉火熱邪盛的功效，從而有利于減少輻射造成的熱性損傷[18-20]。另外，本研究結果顯示，低劑量輻射組與中劑量輻射組孕鼠SOD、GSH-Px水平均低于空白對照組，而MDA水平高于空白對照組；低劑量輻射+補腎解毒方與中劑量輻射+補腎解毒方組孕鼠SOD、GSH-Px水平均高于空白對照組，而MDA水平低于空白對照組。這提示中藥補腎解毒方對輻射后孕鼠的氧化應激反應具有一定的緩解作用。究其原因可能在于冬蟲夏草可有效調節抗氧化酶基因的表達，從而在一定程度上提升放射損傷小鼠的抗氧化能力；而白花蛇舌草具有一定的抗氧化作用。二者聯合應用具有一定的協同作用，繼而使氧化應激指標水平得到改善。由此可推測補腎解毒方對孕鼠的輻射防護作用機制可能和預防、修復胎盤組織氧化損傷有關。

綜上所述，中藥補腎解毒方對輻射后孕鼠胎盤損傷的防護作用顯著，可明顯減輕氧化應激損傷，改善孕鼠妊娠結局，值得臨床重點關注。