環介導等溫擴增技術對慢性阻塞性肺疾病急性加重伴下呼吸道感染的診斷價值

溫雅，杜焰家，黃娟，曾漢華，鐘子雙，張偉強

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是以持續氣流受限為特征的呼吸系統疾病，下呼吸道感染是慢性阻塞性肺疾病急性加重（acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease，AECOPD）的常見合并癥，但長期接受抗感染治療的AECOPD患者細菌耐藥情況嚴重、治療難度增加［1］。目前，臨床上主要通過呼吸道病原菌培養方法明確AECOPD伴下呼吸道感染患者的致病菌，但該方法耗時較長，容易錯過最佳治療時機［2］。環介導等溫擴增技術（loop mediated isothermal amplification，LAMP）可以進行多種細菌、結核分枝桿菌的核酸檢測，具有快速、敏感等優勢，可早期明確致病菌，為抗菌藥物的選擇提供依據［3-4］。鑒于LAMP的優勢，將其用于AECOPD伴下呼吸道感染的診斷或可進一步提高其診斷效能。為此，本研究分析了LAMP對AECOPD伴下呼吸道感染的診斷價值。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2020—2021年在梅州市人民醫院住院的AECOPD伴下呼吸道感染患者500例，均符合《慢性阻塞性肺疾病急性加重診治中國專家共識（草案）》［5］中的AECOPD診斷標準，且經影像學檢查確診為下呼吸道感染，血清炎癥指標升高，提示伴有下呼吸道細菌或非典型病原體或結核桿菌感染。所有患者中男433例，女67例；年齡（72.2±9.9）歲；有吸煙史316例（占63.20%）；行機械通氣328例（占65.60%）；合并癥：高血壓137例（占27.40%），冠心病73例（占14.60%），2型糖尿病52例（占10.40%）。本研究經梅州市人民醫院醫學倫理委員會審核批準（梅市倫審2020-CY-18）。

1.2 納入、排除及剔除標準 納入標準：（1）年齡18～100歲；（2）患者和/或家屬同意留取痰液或支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）并送檢；（3）采用敏感抗生素治療或抗結核治療有效。排除標準：（1）不適合行電子支氣管鏡檢查及鏡下支氣管肺泡灌洗術者；（2）合并其他臟器嚴重感染、HIV感染者。剔除標準：（1）采集的標本不符合臨床檢驗標準者；（2）檢測結果提示可能存在標本污染者。

1.3 研究方法 本研究為橫斷面研究。患者入院后留取痰液或BALF，同時采用LAMP和病原菌（細菌、真菌、結核分枝桿菌）培養方法進行檢測。共500份標本采用LAMP方法檢測，其中痰液336份、BALF 164份；共530份標本采用病原菌培養方法進行檢測，其中28例患者同時進行細菌+真菌和結核分枝桿菌培養，2例患者同時進行兩份細菌+真菌培養。

1.3.1 BALF、痰液的采集及處理 參考《成人診斷性可彎曲支氣管鏡檢查術應用指南（2019年版）》［6］及《肺部感染性疾病支氣管肺泡灌洗病原體檢測中國專家共識（2017年版）》［7］操作規范。電子支氣管鏡檢查術前做好禁食禁水準備，采取利多卡因局部麻醉/局部麻醉+鎮靜鎮痛的麻醉方式；術中全程監測患者呼吸、血壓、脈搏、指脈氧，觀察患者的臨床癥狀；術后囑患者禁食、禁水2 h，并觀察患者術后不良反應發生情況。根據胸部CT定位將支氣管鏡經鼻插入至目標亞段支氣管，病變局限者選擇病變段，彌漫性病變者選擇右肺中葉或左上葉舌段，清除局部痰液后注入室溫0.9%氯化鈉溶液30～60 ml，進行病變部位支氣管肺泡灌洗，回收15～30 ml BALF，要求回收率≥30%。患者在醫務人員指導下自主咳出深部痰液或在電子支氣管鏡下吸出痰液，標本符合《全國臨床檢驗操作規程（第4版）》［8］，2 h內送檢實驗室。

1.3.2 LAMP LAMP為呼吸道病原菌核酸聯合檢測，首先采用細菌DNA提取試劑盒（博奧生物集團有限公司）提取病原菌DNA，按照呼吸道病原菌核酸檢測試劑盒（博奧生物集團有限公司）說明書，采用等溫擴增法和微流控芯片法相結合的方法，對病原菌進行檢測，24 h內可獲得結果。采用呼吸道病原菌核酸檢測軟件對檢測結果進行可視化分析，本研究共檢測到13種病原菌：肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌、嗜麥芽窄食單胞菌、流感嗜血桿菌、嗜肺軍團菌、肺炎支原體、肺炎衣原體、結核分枝桿菌復合群。

1.3.3 病原菌培養方法 按照臨床常規細菌/真菌培養操作標準，將標本接種在已處理的培養皿中，經恒溫培養箱，采用VITEK2自動微生物分析儀檢測細菌，采用真菌分析儀檢測真菌，采用液基培養方法檢測結核分枝桿菌。

1.4 統計學方法 采用SPSS 23.0統計學軟件處理數據。符合正態分布的計量資料以（±s）表示；計數資料以〔n（%）〕表示，組間比較采用χ2檢驗或McNemar配對檢驗；LAMP與病原菌培養方法檢測病原菌的一致性分析采用Kappa檢驗，其中Kappa值≥0.75提示一致性高、0.40≤Kappa值＜0.75提示一致性一般、Kappa值＜0.40提示一致性差。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 LAMP檢測結果 LAMP檢測結果顯示，BALF中病原菌檢出率為30.49%（50/164），痰液中病原菌檢出率為45.24%（152/336）；痰液中病原菌檢出率高于BALF，差異有統計學意義（χ2=9.958，P=0.002）。其中行機械通氣者耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌檢出率及單一感染發生率高于未行機械通氣者，結核分枝桿菌復合群檢出率低于未行機械通氣者，差異有統計學意義（P＜0.05）；行機械通氣者與未行機械通氣者肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌、嗜麥芽窄食單胞菌、流感嗜血桿菌、嗜肺軍團菌檢出率及混合感染發生率比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。

表1 行機械通氣者與未行機械通氣者LAMP檢測結果比較〔n（%）〕Table 1 Comparison of LAMP detection results between patients with mechanical ventilation and patients without mechanical ventilation

2.2 LAMP與病原菌培養方法檢測結果比較 采用LAMP檢出病原菌202份，病原菌檢出率為40.40%（202/500）；采用病原菌培養方法檢出病原菌130份，病原菌檢出率為24.53%（130/530）。LAMP的病原菌檢出率高于病原菌培養方法，差異有統計學意義（χ2=29.671，P＜0.001）。其中LAMP對肺炎鏈球菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、流感嗜血桿菌、單一感染、混合感染檢出率高于病原菌培養方法，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 LAMP與病原菌培養方法檢測結果比較〔n（%）〕Table 2 Comparison of detecting result between LAMP and pathogen culture

2.3 LAMP與病原菌培養方法檢測病原菌結果的一致性LAMP與病原菌培養方法檢測銅綠假單胞菌結果的Kappa值為0.708，檢測金黃色葡萄球菌結果的Kappa值為0.611，檢測嗜麥芽窄食單胞菌結果的Kappa值為0.421，見表3。

表3 LAMP與病原菌培養方法檢測病原菌結果的一致性分析（例）Table 3 Consistency analysis of LAMP and pathogen culture methods in detecting pathogenic bacteria

3 討論

下呼吸道感染是誘發AECOPD的主要因素之一，尤其是肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌等細菌，其進入下呼吸道后會損傷患者肺功能，加重患者咳喘、呼吸困難癥狀，甚至危及患者生命［9］。本研究中500例AECOPD伴下呼吸道感染患者以老年男性為主，大部分患者有吸煙史，接受過機械通氣治療。老年患者機體功能減退，抵抗力減弱，容易并發下呼吸道感染；煙草中的尼古丁、一氧化碳等有毒物質會加重COPD患者的呼吸道損傷，增加病原菌感染風險；接受機械通氣治療亦可增加呼吸道感染發生概率［10-11］。目前，臨床上主要通過臨床特征與癥狀及胸部CT檢查結果確定COPD患者是否伴發下呼吸道感染［12］，但無法明確其感染病原菌的類型，故需要進一步明確病原菌以采取針對性治療。但由于病原菌的體外培養條件苛刻，且培養時間較長，假陰性結果較多，導致僅有部分COPD患者可在痰液中發現病原菌［13］。

近年來隨著支氣管肺泡灌洗技術的廣泛應用，BALF檢查得到普及，這為AECOPD伴下呼吸道感染患者的病原菌檢測提供了有利條件［14］。本研究結果顯示，痰液中病原菌檢出率高于BALF，其原因可能與痰液中病原菌含量更高有關；且LAMP對病原菌的檢出率高于病原菌培養方法。本研究中500例AECOPD伴下呼吸道感染患者以單一感染為主，革蘭陰性菌感染居多，其中行機械通氣者以耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、流感嗜血桿菌感染為主，未行機械通氣者以流感嗜血桿菌、銅綠假單胞菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、結核分枝桿菌復合群感染為主，且行機械通氣者耐甲氧西林金黃色葡萄球菌檢出率高于未行機械通氣者。既往研究表明，我國下呼吸道感染患者感染病原菌以革蘭陰性菌為主，其中肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌均為常見條件致病菌，其廣泛存在于自然界，對免疫力低下者可造成嚴重危害；銅綠假單胞菌具有黏多糖與鞭毛，容易黏附在呼吸道黏膜上皮，引起呼吸道感染［15-17］。一項病原菌分離及耐藥研究顯示，不同病程的COPD患者感染的病原菌均以革蘭陰性菌為主，主要為鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌等［18］。國外研究表明，AECOPD患者采用痰培養分離出的病原菌主要為銅綠假單胞菌（38.23%）、肺炎克雷伯菌（29.41%）、金黃色葡萄球菌（23.53%）、肺炎鏈球菌（5.88%）［19］。因COPD患者經常使用抗生素、糖皮質激素及接受機械通氣治療，故其常伴有肺部重癥感染，導致條件致病菌耐甲氧西林金黃色葡萄球菌感染比例升高［20］。此外，老年COPD患者因氣道慢性炎癥也容易并發結核分枝桿菌感染［21-23］。上述研究結果存在的差異亦提示，下呼吸道感染的病原菌分布可能與地域、種族、合并疾病、治療方法等有關。

本研究結果顯示，LAMP對肺炎鏈球菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、流感嗜血桿菌的檢出率高于病原菌培養方法，提示LAMP對于一些苛養菌、條件致病菌的診斷效能較病原菌培養方法好，對于病原菌培養方法容易檢測的病原菌，LAMP也較敏感；但LAMP與病原菌培養方法檢測銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、嗜麥芽窄食單胞菌結果的一致性一般，檢測其他病原菌結果的一致性較差。LAMP是一種利用分子生物學分析病原菌核酸的檢測技術，可同時分析十多種常見病原菌，故可為AECOPD伴下呼吸道感染患者的抗菌藥物選擇提供依據；此外，該技術最快可在2 h內出具檢測結果，具有迅速、便捷等優點［24-26］。

綜上所述，與病原菌培養方法相比，LAMP對AECOPD伴下呼吸道感染患者的病原菌檢出率更高，尤其是肺炎鏈球菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、流感嗜血桿菌等苛養菌或條件致病菌；且采用LAMP檢測AECOPD伴下呼吸道感染患者時，其痰液中病原菌檢出率高于BALF。但本研究為單中心研究，且樣本量有限，未來仍需要多中心、大樣本量研究進一步驗證本研究結論。

作者貢獻：溫雅、杜焰家進行文章的構思與設計、結果分析與解釋；溫雅、張偉強進行研究的實施與可行性分析；溫雅、黃娟、曾漢華、鐘子雙進行數據收集、整理、分析；溫雅撰寫、修訂論文，負責文章的質量控制及審校，并對文章整體負責、監督管理。

本文無利益沖突。