中國漢族人群NR3C1 MTHFR和IGFBP3基因多態(tài)性及DNA甲基化與激素性股骨頭壞死風險的相關分析

倪 瓊 詹慶昊 黃榮蘭 胡文彬 楊任民 程 楠 韓永升

股骨頭壞死是由于股骨頭血供中斷引起骨細胞的凋亡和股骨頭內微結構的改變，出現股骨頭區(qū)域疼痛并進行性加重的一種疾病。大多數患者最終需要進行人工關節(jié)置換，長期效果難以預測[1]。研究[2]已確定過度飲酒和服用大劑量糖皮質激素藥物是發(fā)生非創(chuàng)傷性股骨頭壞死的2個最重要的誘因。因此，激素性股骨頭壞死(steroid-induced osteonecrosis of the femoral head，SONFH)的早期檢測、有效治療尤為重要。近年來，基于候選基因的關聯研究成功地定位了許多復雜疾病的易感性[3-4]，也有研究[5]將特定基因與股骨頭壞死聯系起來，表明遺傳因素可能與股骨頭壞死的發(fā)生有關。

糖皮質激素受體基因NR3C1是介導糖皮質激素發(fā)揮作用的重要轉錄調控因子，存在較多的突變及多態(tài)性，影響個體對外源性糖皮質激素的敏感性[6]。NR3C1 BclI (rs41423247)基因多態(tài)性是一種比較常見的多態(tài)性變異，并已報告與高血壓和糖皮質激素敏感性增加有關[7-8]。NR3C1rs6196 A等位基因攜帶者與G等位基因攜帶者相比，有更高的糖皮質激素耐藥風險。與G等位基因相比，rs10052957和rs258751 A等位基因的存在可以降低糖皮質激素耐藥的發(fā)生率[9]。NR3C1 DNA甲基化與抑郁、焦慮、創(chuàng)傷后心理壓力緊張綜合征、神經性貪食癥和邊緣性人格障礙有關[10-13]。亞甲基四氫葉酸還原酶(methylenetetrahydrofolate reductase,MTHFR)基因可編碼5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶，MTHFR的基因突變會顯著降低酶的活性，導致血漿同型半胱氨酸水平升高，從而增強了破骨細胞活力對骨組織產生直接的損害作用[14]。MTHFR基因的677C>T(rs1801133)變體與血漿同型半胱氨酸水平升高有密切的聯系[15]。較高的同型半胱氨酸濃度可能會阻礙膠原的合成，進而導致骨質量的下降和股骨頭壞死風險的增加[16]。同型半胱氨酸升高與rs1801133多態(tài)性和低甲基化之間有相關聯系[17]。胰島素樣生長因子結合蛋白-3(insulin like growth factor bind protein 3,IGFBP3)是血清IGF1的主要載體，通過與配體競爭性結合抑制IGF1。IGF1通過自分泌和旁分泌調節(jié)成骨細胞的增殖和分化[18]。IGFBP3基因的DNA甲基化能通過神經體液、炎癥、氧化應激等機制來調控基因表達和影響疾病發(fā)生發(fā)展。有研究[19-20]證明影響血管的IGFBP3基因的SNPs與多個CpG位點的甲基化有關。

DNA甲基化是目前研究最為深入的一種表觀遺傳修飾，可對轉座子和基因表達產生抑制，也可激活一些基因的轉錄。筆者先前已證實基因CYP450的rs2242480 T等位基因與SONFH發(fā)生風險降低相關[21]。目前，只有少數研究探討NR3C1, MTHFR和IGFBP3基因多態(tài)性和甲基化與 SONFH的關系。本研究對上述3個基因的SNP位點及陽性位點的DNA甲基化水平進行測定，以期進一步了解SONFH的生物學和生理學機制，為該病的個體化治療提供依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2018-2021年共招募了來自安徽中醫(yī)藥大學神經病學研究所附屬醫(yī)院、安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院、安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院和宿州醫(yī)院、合肥市第八人民醫(yī)院、中山大學第三附屬醫(yī)院和南昌大學醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院等共82例股骨頭壞死患者。其中79例患者有在患視神經脊髓炎病、多發(fā)性硬化、重癥肌無力、急性淋巴細胞白血病或系統性紅斑狼瘡等疾病接受短期沖擊或長期口服糖皮質激素治療史，為本研究的病例組，均符合SONFH的診斷標準[22]。3例患者因其他非糖皮質激素原因造成的股骨頭壞死被排除在外。根據安徽中醫(yī)藥大學神經病學研究所附屬醫(yī)院的醫(yī)學檢查，招募了口服糖皮質激素(強的松>30 mg/d)治療3個月后,臨床觀察3年以上未發(fā)生股骨頭壞死的114例患者作為對照組，所有參與者為在合肥及周邊地區(qū)居住或住院就診的中國漢族人口。每位參與者均簽署一份知情同意書。安徽中醫(yī)藥大學神經病學研究所附屬醫(yī)院倫理委員會批準了該研究[倫理批號：2018倫字(07)號]。

1.2 納入與排除標準 納入標準：①長期口服或短期沖擊使用糖皮質激素，累計相當于強的松>30 mg/d超過3個月；②采用《中國成人股骨頭壞死臨床診療指南(2020)》[23]確診為SONFH的患者；③均攝雙側髖關節(jié)正、蛙位片和雙髖磁共振檢查；④簽署知情同意書。排除標準：①未獲得知情同意者;②創(chuàng)傷性股骨頭壞死及其他非糖皮質激素原因造成股骨頭壞死者;③病史不全或嚴重缺陷影響觀察者。

1.3 提取基因及基因分型 基因組DNA提取使用DNA純化試劑盒(Promega, Madison, Wisconsin, USA)，按照產品說明書進行。目標基因SNP位點采用Genesky生物技術公司(上海，中國)開發(fā)改良的iMLDR技術進行分型。采用多重聚合酶鏈式反應(PCR)檢測進行iMLDR的研究。對每個單核苷酸多態(tài)性，用不同的熒光標記來區(qū)分等位基因特異性寡核苷酸探針對。不同的SNP在3'端被進一步區(qū)分為不同的延長長度。設置兩組陰性對照:一組以雙蒸餾水為模板，另一組為不加引物的DNA樣品，其他條件保持不變。采用ABI3730XL自動測序儀(Applied Biosystems)對占總DNA樣品約5%(n=20)的隨機樣本進行直接測序，以確認iMLDR的結果。

1.4 CpG島選擇 選取位于NR3C1、MTHFR和IGFBP3基因近端啟動子的CpG島，按照以下標準進行測量:①最小長度為200 bp;②GC含量在50%以上;③0.60或更高的觀察/預期二核苷酸CpG比值。

1.5 亞硫酸氫鹽轉換和多重放大 DNA甲基化水平采用甲基化靶(MethylTargetTM, Genesky Biotechnologies Inc， Shanghai, China)分析，這是一種基于NGS的多靶點CpG甲基化分析方法。利用基因CpG軟件對感興趣的基因組區(qū)域進行分析，并將其轉化為bisulfit-convert序列。利用硫酸氫鹽轉化DNA的甲基化引物軟件設計PCR引物。使用EZ DNA甲基化TM-GOLD試劑盒(Zymo Research)按照制造商協議對基因組DNA(400 ng)進行亞硫酸鈉處理。用優(yōu)化的引物組合進行多重PCR。

1.6 測序 將來自不同樣本的庫進行量化并匯集在一起，在Illumina NextSeq平臺上進行排序。測序采用2×150 bp雙端模式。

2 結果

2.1 一般資料比較 病例組79例，其中女性45例，男性34例，平均年齡(50.65±13.95)歲；對照組114例，其中女性65，男性49例，平均年齡(42.63±19.27)歲。病例組與對照組相比，年齡差異有統計學意義(t=3.331，P=0.001)，性別差異無統計學意義(t=0.127，P=0.899)。

2.2 SNP位點信息及Hardy-Weinberg平衡檢驗 選擇了5個SNP位點(NR3C1基因的rs10052957、rs41423247位點；MTHFR基因的rs1801133位點；IGFBP3基因的rs2453839、rs3110697位點)，對所有樣本采用iMLDR技術進行基因分型并做HWE檢驗質控，所有位點的P值均>0.05，符合平衡，數據可用。見表1。

表1 SNP位點信息與Hardy-Weinberg平衡檢驗

2.3 SNP位點等位基因及基因型頻率與SONFH的關聯分析 病例組與對照組中的5個SNP位點的2個等位基因頻率在logistic回歸分析中發(fā)現，rs3110697位點與SONFH有關聯，差異有統計學意義(P<0.05)。rs3110697位點的基因型頻率分布差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 對照組和病例組等位基因和基因型頻率與SONFH風險的相關性分析

2.4 SNP位點與SONFH的遺傳模型關聯分析 遺傳模型分析發(fā)現，IGFBP3基因的rs3110697位點，在隱性遺傳模型下，差異具有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 病例組與對照組遺傳模型分析

2.5 連鎖不平衡分析 對NR3C1及IGFBP3的SNP位點使用haploview軟件進行連鎖不平衡分析存在關聯的單倍型，發(fā)現SNP位點間均不具有較強的連鎖關系。見圖1。

注：方框中的顏色與數字均表示SNP之間的連鎖程度強弱，數字越大，表示SNP之間關聯性越強。

2.6 甲基化數據分析

2.6.1 甲基化檢測片段信息 采用Primer3(http://primer3.ut.ee/)軟件對亞硫酸氫鹽處理之后的序列進行引物設計。見表4。

表4 甲基化檢測片段引物序列信息

2.6.2 CpG位點甲基化水平差異 本研究共檢測CpG位點164個，對每個CpG位點甲基化水平進行差異顯著性檢驗，篩選具有顯著甲基化水平差異的CpG位點。病例組與對照組相比，CpG位點IGFBP3_2-143，MTHFR_1-36、-77、-139，MTHFR_2-42，NR3C1_2-163，NR3C1_4-47邏輯回歸檢驗P<0.05，差異有統計學意義。見表5。

表5 CpG位點甲基化水平顯著差異信息

2.6.3 SNP位點與甲基化交互作用分析 通過基因表達數量性狀定位(expression quantitative trait loci,e QTL)作圖方法將所有SNP分型結果與對應位點基因甲基化水平交互作用進行線性回歸分析。共10對SNP與甲基化位點之間的線性回歸檢驗P<0.05，差異有統計學意義。見表6。

表6 SNP和CpG位點間交互作用的meQTL分析

3 討論

近年來，糖皮質激素已被認為是引起非創(chuàng)傷性股骨頭壞死的首要致病因素[24]。既往研究[25]證實，大多數糖皮質激素的作用是由糖皮質激素受體介導的。糖皮質激素受體由激素結合域、DNA結合結構域和氨基末端區(qū)域組成，在糖皮質激素敏感性中起決定作用[26]，其作用的分子機制的改變能改變組織對糖皮質激素的敏感性從而導致耐藥或過敏，并引起嚴重的并發(fā)癥。股骨頭壞死(osteno narosis of the femoral head,ONFH)和低纖維蛋白溶解或血栓形成傾向之間的遺傳聯系已經被報道過[27]，MTHFR和血漿纖溶酶原激活抑制劑-1(PAI-1)等凝血相關因子與ONFH的發(fā)生有關。因此，凝血和血管生成機制也被認為是影響ONFH的主要因素。本研究希望通過對SONFH相關基因NR3C1、MTHFR和IGFBP3多態(tài)性及DNA甲基化水平交互作用的遺傳結構研究，探討該病的發(fā)病機理，以期為疾病的診療提供依據。

NR3C1的rs41423247多態(tài)性是糖皮質激素受體基因外顯子2內含子2連接區(qū)下游的C→G核苷酸發(fā)生變化[28]，與類風濕性關節(jié)炎和健康人對外源性糖皮質激素敏感性的變化有關[29-30]。本研究中，首次篩選出了NR3C1_2-163和NR3C1_4-47 2個顯著甲基化水平差異的CpG位點，發(fā)現NR3C1基因SNPs與DNA甲基化之間具有相關性，表明NR3C1基因的表觀遺傳修飾可與基因多態(tài)性產生交互作用，為SONFH的發(fā)病機制研究提供了新的視角。但沒有發(fā)現NR3C1基因型頻率與SONFH的易感性關系，這可能與本研究選擇的研究對象有關，本研究招募的對照組人員來自同一所醫(yī)院，但是SONFH患者血液標本卻是從不同醫(yī)院獲取，在關聯分析中受人口混雜因素影響。進一步研究，需要控制地區(qū)差異對研究結果的干擾。

MTHFR的rs1801133多態(tài)性是由第677位點突變導致的，突變導致的酶活性下降可引起同型半胱氨酸水平增高[31]。同型半胱氨酸會影響創(chuàng)傷愈合、骨骼重塑。Zalavras等[32]在66例患者的對照研究中報道了非創(chuàng)傷性股骨頭壞死的發(fā)生率與rs1801133基因突變有顯著的統計學差異。有研究不支持此結果，韓國的一項包含443例ONFH患者和273名健康受試者的病例對照研究對15個SNPs進行了基因分析，發(fā)現MTHFR基因的rs1801133多態(tài)性與非創(chuàng)傷性股骨頭壞死基因易感性之間并沒有明顯的聯系，但作者認為地區(qū)和種族的不同可能影響了個體間的MTHFR基因多態(tài)性[33]。Shang等[34]對MTHFR基因rs1801133多態(tài)性與ONFH的相關性研究進行了進一步的Meta分析，發(fā)現在亞洲人群中找不到rs1801133多態(tài)性與ONFH的相關性，但是在非洲人群中可以找到與ONFH的重要聯系，認為MTHFR基因的rs1801133多態(tài)性是非洲人群ONFH的主要危險因素。Chai等[35]的Meta分析對種族進行分層，結果顯示ONFH易感性和rs1801133多態(tài)性之間沒有直接聯系。基于以上研究結果，課題組把rs1801133納入本研究中，單獨分析了ONFH中的SONFH，希望可以解釋文獻報道的MTHFR基因與SONFH的各種關聯。但是本研究結果也與多數研究結果一致，并沒有發(fā)現rs1801133多態(tài)性與SONFH的顯著相關性。需注意，本研究不包括對止血機制的評估，此外，本研究也沒有測量同型半胱氨酸水平，rs1801133多態(tài)性可能通過促進血管內凝血導致SONFH的假設仍有待證實。但本研究在分析SNPs與甲基化水平交互作用時，得出MTHFR1-36、MTHFR_1-77、MTHFR_1-139、MTHFR_2-42等位點的甲基化水平差異存在統計學意義。說明在SONFH的發(fā)生發(fā)展中，MTHFR的表觀遺傳學可能是連接環(huán)境因素和SONFH基因相互作用的重要橋梁。

IGFBP3是IGF1在血循環(huán)中的主要載體，能夠延長IGF1在血液循環(huán)中的半衰期。IGF1能夠促進骨骼細胞增殖，增加骨骼長度，參與了蛋白質代謝調節(jié)，誘導維生素D活化[36]。IGFBP3在缺氧誘導的血管生成中發(fā)揮作用[37]，并且與動脈粥樣硬化有關[38]。有研究觀察IGFBP3rs2453839與子宮內膜癌風險關系時，證實IGFBP3的遺傳變異可能影響白種人的子宮內膜癌風險[39]，涉及到了種族因素。Hong等[40]采用Affymetrix靶向基因分型3K芯片陣列對460例ONFH患者和300例對照者進行了相關研究，發(fā)現韓國人群中IGFBP3基因的SNPs與ONFH風險增加有關；rs2453839在隱性模型中與酒精誘發(fā)的ONFH和特發(fā)性ONFH有顯著相關性；攜帶rs2453839的小純合子等位基因(CC)的受試者有較高的ONFH發(fā)病風險。Song等[41]納入ONFH臨床分期，得出與正常對照組相比，SONFH組IGFBP3rs2453839 TT和CT頻率分別呈上升和下降趨勢；多態(tài)性與臨床表型的關聯分析表明IGFBP3基因rs2453839 TT型SONFH患者的病程明顯短于CT+CC攜帶者。Ⅲ/Ⅳ期雙側髖部病變組CT+CC基因型頻率顯著高于Ⅲ/Ⅳ期單側病變組和Ⅱ/Ⅲ期雙側病變組。另一項對照研究中，IGFBP3基因rs3110697和rs2453839的主要模型與ONFH的風險增加顯著相關，rs2453839的基因型也與臨床分期密切相關；與對照組相比，ONFH組中IGF1的統計量增加了，血清三酰甘油和低密度脂蛋白膽固醇水平相較于對照組明顯升高，但血清高密度脂蛋白膽固醇水平相較對照組則明顯降低[42]。因此，本研究認為IGFBP3基因多態(tài)性可能影響血液循環(huán)，損害股骨頭，進一步導致SONFH。在本研究中，證實了IGFBP3基因的rs3110697多態(tài)性與中國漢族人群SONFH的發(fā)生有關。與對照組相比，rs3110697的A/G基因型攜帶者患病風險較低；在隱性遺傳模型中，rs3110697的A等位基因攜帶者的患病風險也較低。本研究發(fā)現CpG位點IGFBP3_2-143可能與IGFBP3基因多態(tài)性有相互作用，從而影響SONFH的發(fā)生；但沒有發(fā)現rs2453839多態(tài)性與SONFH的相關性。

綜上所述，SONFH是一個多基因遺傳病，涉及激素受體、代謝轉運、氧化應激、遺傳、神經突觸、脂質及骨代謝等多種機制，本研究首次證實了在中國漢族人群中NR3C1、MTHFR和IGFBP3基因的表觀遺傳修飾可與遺傳基因多態(tài)性產生交互作用影響SONFH，基于對該病的遺傳結構特征的研究可以準確把握該疾病的發(fā)展規(guī)律。

本研究也存在一些局限性。首先，本研究不包括生物學功能的分析，這對闡明NR3C1、MTHFR和IGFBP3基因在SONFH的作用至關重要。另外，糖皮質激素治療病例中的骨壞死并不意味著單純的糖皮質激素可能導致它。應考慮所有可能的風險因素，如基礎疾病，因為在大多數情況下，這是導致SONFH的累積效應[43]。其次，SONFH還需要分為不同的臨床分期進行進一步分析。再次，本研究的病例組與對照組人員都是自合肥及周邊地區(qū)招募的漢族人口，這可能存在區(qū)域選擇偏差。最后，本研究納入的病例組與對照組平均年齡差異較明顯，可能存在結果誤差。進一步的功能性研究和更大規(guī)模的病例對照研究有望避免這些問題，使本研究的結論更具有說服力。