三磷酸腺苷結合盒轉運體a3基因外顯子10多態性與新生兒呼吸窘迫綜合征易感性的關系

王雪芹 楊曉宇

作者單位： 475000 河南開封 開封市兒童醫院新生兒科

新生兒呼吸窘迫綜合征(respiratory distress syndrome of newborn，NRDS)主要是因患兒肺發育不全、肺表面活性物質(pulmonary surfactant，PS)缺乏等因素造成肺泡病理改變而引起[1]。PS缺乏可加重肺泡毛細血管內皮損傷，導致肺泡塌陷和肺液集聚，而誘發NRDS[2-3]。有研究[4-5]顯示，基因遺傳因素也是影響PS結構功能，引起PS代謝循環障礙，導致NRDS發病的重要因素。ATP結合盒轉運子A3(ATP binding cassette transporter A3，ABCA3)是ATP結合盒轉運子的亞科，可協助脂類跨膜轉運而影響PS的合成。ABCA3基因外顯子10位點位于α螺旋跨膜結構域，可利于不同底物結合、轉運，該位點基因多態性可改變信使RNA穩定性，而影響擴膜結構域的完整性，導致脂質轉運功能異常[6]。而目前對于該基因變異位點與NRDS的關系報道較少。故本研究通過分析新生兒ABCA3外顯子10多態性與NRDS發生及進展的關系，旨在為探尋NRDS發病的分子遺傳性機制及為該疾病的臨床防治提供參考依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取73例2020年1月至2022年2月開封市兒童醫院住院/門診診療的NRDS患兒為NRDS組，選取同期58例健康新生兒為對照組。兩組研究對象性別、胎齡等一般資料對比差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 NRDS組與對照組的一般資料比較

1.2 納入排除標準 納入標準：①NRDS組對象均符合NRDS的診斷標準[7]，出生后數小時內出現呼吸急促，達60次/分以上，伴呼氣性呻吟，吸氣時三凹征，病情進行性加重，繼而出現呼吸不規則、呼吸暫停、青紫、呼吸衰竭。體檢兩肺呼吸音減低，血氣分析提示二氧化碳分壓升高，氧分壓下降等；②臨床資料完整者；③單胎妊娠。排除標準：①敗血癥患兒；②合并嚴重先天性疾病患兒；③有胎糞吸入史者；④多胎妊娠；⑤肺氣漏、先天性肺發育不良等肺部疾病患兒。本研究經倫理委員會審核批準(倫理審批號:2021KW037-12)。

1.3 方法

1.3.1 ABCA3外顯子10多態性檢測 采集NRDS組及對照組對象外周靜脈血500 μL，應用血液基因組DNA提取試劑盒(上海生工生物)提取總DNA，采用PCR法對所提取的DNA樣本進行擴增，擴增引物由上海生工生物設計完成，應用Verity96well型PCR儀(美國ABI公司)進行檢測，ABCA3基因外顯子10rs13332514位點引物序列為SC745-F：5’-CTGTCAATGTCCCACTCCTCTC-3’，SC745-R：5’-TTCTCCCTAAATTACGCTGACTT-3’，擴增長度為413 bp。應用DYY-8C型電泳儀(北京六一儀器廠)，使用1%的瓊脂糖電泳進行電泳處理。應用3730XL型測序儀(美國ABI公司)進行序列測定，測序結果與GenBank基因庫正常序列進行比對判讀。

1.3.2 肺表面活性物質表達 采集NRDS組患兒外周靜脈血2 mL，在4℃環境下，應用上海醫療器械有限公司TGL-14G臺式高速離心機以3 500 r/min的速率進行離心處理，離心半徑為10 cm，離心時間為5 min。取上清液，應用ELISA雙抗體夾心法檢測患兒血清中肺表面活性相關蛋白A(pulmonary surfatcant-associated protein-A，SP-A)、肺表面活性相關蛋白B(pulmonary surfatcant-associated protein-B，SP-B)、肺表面活性相關蛋白C(pulmonary surfatcant-associated protein-C，SP-C)水平，試劑盒由武漢伊艾博科技有限公司提供。取患兒支氣管灌洗液3 mL，單層無菌紗布過濾后以800 r/min離心10 min，離心半徑為10 cm，取上清液進行檢測，以氨萘磺酸法測定患兒BALF中總磷脂(total phospholipids，TPL)水平，四氧化鋨反應后中性鋁粉柱層析法測定患兒BALF中飽和卵磷脂(saturated phosphatidylcholine，SatPC)水平；采用改良Folin酚試劑法測定患兒BALF中總蛋白(total protein，TP)水平。

1.4 觀察指標比較 NRDS組及對照組ABCA3基因外顯子10多態性差異。根據嚴重程度將NRDS組分為4級[7]，參照文獻[8]，以Ⅰ、Ⅱ級為輕度組，Ⅲ、Ⅳ級為重度組，比較不同嚴重程度及不同胎齡患兒的ABCA3外顯子10多態性差異。

2 結果

2.1 NRDS組及對照組ABCA3基因外顯子10多態性的Hardy-Weinberg平衡分析 NRDS組及對照組ABCA3基因外顯子10 rs13332514位點基因型均符合Hardy-Weinberg平衡，兩組該位點GG、GT、TT型實際頻率與理論頻數比較，差異均無統計學差異(P>0.05)。見表2。

表2 NRDS組及對照組ABCA3基因外顯子10多態性的Hardy-Weinberg平衡分析

2.2ABCA3基因外顯子10多態性與NRDS發病的logistic回歸分析 NRDS組ABCA3基因外顯子10rs13332514位點TT型檢出率高于對照組，GG型檢出率低于對照組(P<0.05)。進行logistic回歸分析時，以研究對象是否出現NRDS為因變量(NRDS發病為1，無NRDS為0)，將ABCA3基因外顯子10基因型(GG、GT、TT)作為自變量，采用似然法納入logistic回歸分析進行多因素分析，結果顯示，ABCA3基因外顯子10rs13332514位點TT型為NRDS發生的危險因素，GG型為保護因素(P<0.05)。見表3、4。

表3 NRDS組及對照組ABCA3基因外顯子10多態性比較[(例)%]

表4 ABCA3基因外顯子10多態性與NRDS發病的logistic回歸分析

2.3 不同NRDS嚴重程度患兒的ABCA3基因外顯子10多態性比較 重度組ABCA3基因外顯子10rs13332514位點TT型檢出率高于輕中度組，GG型檢出率低于輕中度組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表5。

表5 不同NRDS嚴重程度患兒的ABCA3基因外顯子10多態性比較[例(%)]

2.4 不同胎齡NRDS患兒的ABCA3基因外顯子10多態性比較 早產兒及足月兒的ABCA3基因外顯子10rs13332514位點GG、GT、TT型檢出率對比，差異無統計學意義(P>0.05)。見表6。

表6 不同胎齡NRDS患兒的ABCA3基因外顯子10多態性比較[例(%)]

2.5 不同ABCA3基因外顯子10基因型患者的肺表面活性物質表達比較 不同基因型患兒SP-A、SP-B、SP-C、SatPC/TPL及SatPC/TP水平對比，差異有統計學意義(P<0.05)；TT型患兒SP-A水平高于GT、GG型，SP-B、SP-C、SatPC/TPL及SatPC/TP水平低于GT、GG型(P<0.05)；GT型SP-A水平高于GG型，SP-B、SP-C、SatPC/TPL及SatPC/TP水平低于GG型(P<0.05)。見表7。

表7 不同ABCA3基因外顯子10基因型患者的肺表面活性物質表達比較

3 討論

NRDS主要是因PS缺乏造成的肺泡張力下降，肺泡擴張受限，患兒多表現為進行性加重的呼吸異常癥狀[9]。目前認為，基因突變引起PS合成分泌減少，是引起NRDS發生的重要因素[10]。ABCA3蛋白在脂質轉運、維持PS中磷脂動態平衡及其合成有著極為重要的作用。有研究發現[11]，部分小鼠敲除ABCA3基因后可出現肺間質增厚現象，提示該基因突變或與肺疾病的發生有關。有學者發現[12-13]，ABCA3基因突變可導致肺間質疾病的發生，該基因突變可使幼兒表現為肺上皮細胞增生，年長兒出現肺小葉重構。本研究結果顯示，NRDS組及對照組ABCA3基因外顯子10rs13332514位點基因型符合Hardy-Weinberg平衡，表明納入的研究對象中不存在近親、化學環境等因素導致的突變率升高、遷移等,樣本具有代表性。本研究結果顯示，NRDS組ABCA3基因外顯子10rs13332514位點GT、TT型檢出率高于對照組，表明NRDS患者ABCA3基因外顯子10基因突變率較高。經進一步分析發現，ABCA3基因外顯子10rs13332514位點TT型為NRDS發生的危險因素，GG型為保護因素，與張鈺恒等[14]研究結果一致。其原因可能在于，ABCA3基因外顯子10突變可引起肺泡內蛋白沉積，肺間質及膠原纖維增生，最終導致NRDS的發生[15]。

臨床研究[16-17]顯示，NRDS的發病率與胎齡有關，胎齡較小新生兒因肺部發育較差，PS產生較少，呼吸、儲備功能較低，導致NRDS發病率較足月兒高。本研究發現，不同胎齡NRDS患兒該位點GG、GT、TT型檢出率差異無統計學意義，提示ABCA3基因多態性或與胎齡無顯著相關。本研究結果顯示，重度NRDS患兒ABCA3基因外顯子10rs13332514位點TT型檢出率較高，這主要是因為ABCA3基因可將磷脂等脂質轉運至板層小體，影響PS的加工過程，進而影響患兒肺功能[18-19]。

國內外均有研究[20-23]顯示，ABCA3蛋白在PS脂類轉運過程中具重要的作用。SP是PS的主要活性成分，存在于支氣管和肺泡表面氣液界面，當肺部出現上皮組織損傷時，肺泡毛細血管屏障被破壞，肺微血管通透性增加，導致SP入血，使得其外周血水平升高[24]。本研究結果顯示，ABCA3基因外顯子10rs13332514位點TT、GT型患兒的SP-A水平高于GG型，與相關研究[25-26]結果相符，這主要與ABCA3基因外顯子10突變型患兒肺部損傷較嚴重有關。ABCA3基因突變可導致該蛋白分泌異常，而繼發性影響SP的轉錄和表達過程[27-28]。但尚不知該基因外顯子10突變是否與SP-B、SP-C表達相關。為此，本研究對不同ABCA3基因外顯子10基因型患者的SP-B、SP-C表達情況進行分析，發現ABCA3基因外顯子10rs13332514位點TT型患兒SP-B、SP-C、SatPC/TPL及SatPC/TP均較GT型和GG型低，提示該位點基因突變可影響SP-B、SP-C等蛋白表達，本研究認為，這或為該基因突變可增加NRDS易感性的重要原因。

綜上所述，ABCA3基因外顯子10基因TT型是NRDS發生的危險因素，并該基因多態性可影響患兒SP表達。本研究尚存在不足之處，納入例數有限，可能導致研究結果出現偏倚，故具體機制還需進一步研究證實。