香菇液體菌種培養(yǎng)過(guò)程中幾個(gè)生理指標(biāo)的變化規(guī)律研究

胡 寶 楊諾林 崔 嫚 郭金英 王春霞 鄭素月

（河北工程大學(xué)園林與生態(tài)工程學(xué)院，河北 邯鄲 056038）

香菇（Lentinula edodes）又名冬菇、香蕈、花菇等，隸屬擔(dān)子菌綱、傘菌目、口蘑科、香菇屬，具有較高的藥用和食用價(jià)值，是著名的食藥用真菌之一[1]，深受人們喜愛(ài)，在我國(guó)民間素有“山珍”“菇中皇后”的美譽(yù)[2,3]。

液體發(fā)酵又稱深層培養(yǎng)，是食用菌工廠化生產(chǎn)中菌種生產(chǎn)的常見(jiàn)技術(shù)之一[4,5]。相比傳統(tǒng)的固體菌種生產(chǎn)，液體菌種培養(yǎng)不受地域限制、生產(chǎn)周期短、發(fā)菌速度快，經(jīng)過(guò)多年的發(fā)展，已逐漸成為食用菌工廠周年化、規(guī)模化生產(chǎn)的首選制種技術(shù)[6]，已廣泛應(yīng)用于工廠化生產(chǎn)金針菇[7]、杏鮑菇[8]等菌類中。目前關(guān)于香菇液體菌種制備的報(bào)道還較少，主要集中在培養(yǎng)基配方和工藝條件優(yōu)化方面[9,10]。

香菇液體菌種生產(chǎn)中的菌種質(zhì)量通常采用菌液顏色變化、菌絲球濃度、培養(yǎng)液pH 變化等常規(guī)方法判定，并多將菌絲體重量作為衡量指標(biāo)[11-13]。然而，食用菌菌種活力與其生理生化指標(biāo)密切相關(guān)，也有學(xué)者通過(guò)測(cè)定白靈菇[14]、草菇[15]液體培養(yǎng)中的可溶性蛋白含量、還原糖含量、酶活性等指標(biāo)，確定最佳培養(yǎng)時(shí)間。還原糖通常是指單糖或寡糖，可被微生物直接利用，液體菌種培養(yǎng)液中還原糖的含量可間接反映菌絲的生長(zhǎng)情況。可溶性蛋白是重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，其在培養(yǎng)液中的含量變化可以反映液體培養(yǎng)菌絲的活力。香菇是典型的木腐菌，漆酶是降解木質(zhì)素的主要酚氧化酶，其酶活的高低能直接反映菌絲分解能力和活性的強(qiáng)弱。目前通過(guò)生理指標(biāo)判斷香菇液體培養(yǎng)終點(diǎn)的研究較少。

本研究通過(guò)測(cè)定分析培養(yǎng)液中的可溶性蛋白含量、還原糖含量及漆酶活性等影響香菇菌絲變化的主要生理指標(biāo)，探索香菇液體菌種的最佳培養(yǎng)時(shí)間，為工廠化生產(chǎn)香菇液體菌種提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

（1）供試菌株。香菇“T2”，由河北工程大學(xué)園林與生態(tài)工程學(xué)院食用菌研究實(shí)驗(yàn)室保藏。

（2）供試培養(yǎng)基。①母種活化培養(yǎng)基PDA 培養(yǎng)基：土豆（去皮）200 g、瓊脂粉20 g、葡萄糖20 g、MgSO43 g、KH2PO41.5 g，VB10.05 g，水1000 mL，pH 自然。②搖瓶液體培養(yǎng)基：土豆（去皮）200 g、葡萄糖20 g、MgSO43 g、KH2PO41.5 g，水1 000 mL，pH 自然。

1.2 試驗(yàn)方法

（1）菌種活化。將香菇菌種接種到PDA 綜合培養(yǎng)基平板上，置于25 ℃恒溫箱中培養(yǎng)，長(zhǎng)滿平板后備用。

（2）培養(yǎng)基配制、接種和培養(yǎng)。搖瓶液體培養(yǎng)基按配方配制好后，裝入300 mL 三角瓶中，每瓶裝液量150 mL，121 ℃滅菌30 min，自然冷卻后接種。接種時(shí)用5 mm 的無(wú)菌打孔器在活化菌株的菌絲邊緣打孔，每個(gè)液體搖瓶接種10 個(gè)菌餅塊，暗光靜置培養(yǎng)24 h 后置于恒溫震蕩培養(yǎng)箱中，25 ℃、170 r/min 恒溫避光震蕩培養(yǎng)。

（3）指標(biāo)測(cè)定。從接種的10 個(gè)搖瓶中，選取3 個(gè)每隔24 h 取樣一次，分別進(jìn)行指標(biāo)測(cè)定，每個(gè)指標(biāo)測(cè)定3 次，取平均值進(jìn)行分析。

1.3 成分測(cè)定

待測(cè)液提取。接種后第二天開(kāi)始取樣，每隔24 h 取樣一次，在無(wú)菌操作條件下，從三角搖瓶中吸取5 mL 培養(yǎng)液，8 000 r/min 離心10 min 備用。

含量測(cè)定。采用考馬斯亮藍(lán)法[16]測(cè)定可溶性蛋白含量。采用DNS 法[17]（3,5-二硝基水楊酸法）測(cè)定還原糖含量。采用ABTS 法測(cè)定漆酶活性：以熱水煮沸滅活酶液樣品作為對(duì)照，另取一支潔凈離心管，吸取粗酶液于離心管中，與配制好的ABTS 試劑充分混勻后，置于恒溫水浴鍋中37 ℃水浴5 min，測(cè)定420 nm 波長(zhǎng)下酶反應(yīng)3 min 內(nèi)的吸光值。

1.4 數(shù)據(jù)記錄與處理

利用Excel 2021 版表格軟件、SPSS-25 軟件，進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)整理與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 香菇液體培養(yǎng)過(guò)程中可溶性蛋白含量

菌絲體的生長(zhǎng)與代謝過(guò)程中，菌絲體內(nèi)生成的可溶性蛋白會(huì)部分滲透到發(fā)酵液中。隨著液體發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間的變化，發(fā)酵液中可溶性蛋白含量也隨之改變。測(cè)定結(jié)果（圖1）表明，液體培養(yǎng)前期2～5天內(nèi)，菌絲處于適應(yīng)恢復(fù)期，菌絲中蛋白含量呈現(xiàn)緩慢上升趨勢(shì)；從第5 天開(kāi)始，可溶性蛋白含量進(jìn)入對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期；培養(yǎng)到第8 天時(shí)，蛋白含量到達(dá)峰值，為81.31 mg/mL，之后開(kāi)始下降。繼續(xù)培養(yǎng)后，顯微鏡檢測(cè)菌絲發(fā)現(xiàn)部分菌絲因空泡導(dǎo)致斷裂或自溶（圖2），此情況可能導(dǎo)致菌絲體內(nèi)蛋白大量流失至發(fā)酵液中，從而使發(fā)酵液中蛋白含量增加。

圖1 不同培養(yǎng)時(shí)間菌絲中可溶性蛋白的含量變化

圖2 培養(yǎng)8 天后的菌絲出現(xiàn)破裂或自融現(xiàn)象

2.2 香菇液體培養(yǎng)過(guò)程中還原糖含量

本研究中還原糖主要來(lái)自于液體培養(yǎng)基中的葡萄糖含量。葡萄糖可作為菌絲生長(zhǎng)的主要碳源，是可被菌絲直接利用的能源之一。還原糖含量的高低，能反映菌絲生長(zhǎng)情況。測(cè)定結(jié)果顯示，在香菇液體菌種培養(yǎng)過(guò)程中，還原糖含量隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢(shì)（圖3）。至第9 天時(shí)，還原糖含量最大，為50.71 mg/mL；第10 天開(kāi)始，菌絲大量吸收并消耗培養(yǎng)基中的糖分，還原糖含量開(kāi)始快速下降，菌絲出現(xiàn)老化、退化，甚至死亡。

圖3 不同培養(yǎng)時(shí)間培養(yǎng)液中還原糖的含量變化

2.3 香菇液體培養(yǎng)過(guò)程中的漆酶活性

漆酶活力是由ABTS 自由基濃度決定的，自由基濃度越高，漆酶活力越旺盛。而產(chǎn)生漆酶的多少，與液體培養(yǎng)基內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)成分有著直接關(guān)系。測(cè)定結(jié)果顯示，在香菇液體培養(yǎng)過(guò)程中，菌絲漆酶活性會(huì)隨時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)（圖4）。接種后的前2～5 天為菌絲適應(yīng)期，菌絲萌發(fā)緩慢，漆酶活性表現(xiàn)不明顯；培養(yǎng)至6～9 天，為菌絲生長(zhǎng)期，菌絲開(kāi)始吸收培養(yǎng)基內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)成分，漆酶活性明顯增高，第9 天達(dá)到最大值；第10 天后，為培養(yǎng)后期，菌絲生長(zhǎng)緩慢，產(chǎn)酶能力下降，并可能伴隨菌絲老化或退化，甚至死亡。

圖4 不同培養(yǎng)時(shí)間的漆酶活性變化

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，香菇液體培養(yǎng)的菌絲中可溶性蛋白含量、漆酶活性以及培養(yǎng)液中還原糖含量，均呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)。根據(jù)測(cè)定結(jié)果，當(dāng)培養(yǎng)至第8 天時(shí)，可溶性蛋白含量最高，為81.31 mg/mL，之后開(kāi)始下降；培養(yǎng)至第9 天時(shí)，還原糖含量和漆酶活性達(dá)到峰值，分別為50.71 mg/mL 和18.43 U/mL，之后隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，各項(xiàng)成分指標(biāo)均下降。因此認(rèn)為，香菇液體菌種培養(yǎng)最佳時(shí)間應(yīng)在第8～9 天。在培養(yǎng)過(guò)程中，還可結(jié)合菌液顏色、菌絲球形態(tài)濃度、菌液pH 變化及菌絲鏡檢鎖狀聯(lián)合等生理指標(biāo)作綜合判定[18]。

目前對(duì)食用菌液體菌種培養(yǎng)過(guò)程中各項(xiàng)生理指標(biāo)測(cè)定的報(bào)道很多，本研究結(jié)果與殷書(shū)平等[19]通過(guò)對(duì)香菇液體培養(yǎng)過(guò)程中各生理指標(biāo)的測(cè)定分析研究得出的香菇液體菌種培養(yǎng)的最佳時(shí)間宜控制在第8 天的結(jié)果基本一致。

影響食用菌液體菌種培養(yǎng)效果的因素有很多，液體培養(yǎng)最佳時(shí)間會(huì)隨內(nèi)在因素（菌種質(zhì)量）和外在因素（培養(yǎng)條件）的影響而發(fā)生改變，生產(chǎn)中須根據(jù)各項(xiàng)生理指標(biāo)進(jìn)行靈活、綜合判定。而液體培養(yǎng)達(dá)到最佳培養(yǎng)終點(diǎn)后，是否出現(xiàn)菌絲的老化、退化或者死亡的判定依據(jù)，還需進(jìn)一步研究驗(yàn)證。